рейтинг блогов

Корона в стоге сена

топ 100 блогов trim_c08.03.2020 Корона в стоге сена

/автор полагает нас специалистами, я во всяком случае понимал не без труда. Мне кажется следует читать так: ревертаза строит полную ДНК, т.е. двойную спираль, при нагревании двойные спирали распадаются на одиночные цепи, полимераза достраивает к фрагменту одиночной цепи, выделенному праймером, его комплементарную цепь, и таким образом удваивается количество нужных фрагментов ДНК/

Таким образом, в каждом цикле мы «размножаем» вирусный геном, и количество молекул ДНК в растворе растет по экспоненте.

Раньше количество ДНК определяли по окончании реакции — пробу обрабатывали красителем для ДНК и разгоняли в геле, чтобы выделить искомые маленькие фрагменты. Тогда чувствительность метода зависела фактически от человеческого глаза — полоска ДНК на геле должна была быть достаточно толстой, чтобы ее можно было различить.

Сейчас метод устроен проще: в смесь для ПЦР сразу добавляют флуоресцентный краситель для ДНК. Поэтому длинные нити начинают светиться, а прибор с каждым циклом замеряет интенсивность свечения. Именно из-за этого сегодня метод называют «ПЦР в реальном времени» (real-time PCR). Теперь мы не зависим от собственного глаза и ограничены лишь чувствительностью прибора к свечению.

Корона в стоге сена

Стадии ПЦР: 1 — денатурация, разъединение цепочек ДНК (при температуре 94–96 градусов Цельсия); 2 — отжиг, праймеры садятся на определенные последовательности ДНК (около 68 градусов Цельсия); 3 — элонгация, полимераза достраивает вторую цепь ДНК, начиная с праймера (около 72 градусов Цельсия).



В контейнере проба со щеки смешивается с образцом белков ВИЧ и «ползет» вверх по тест-полоске. До верхней полоски «добегают» свободные антитела, на нижней полоске «останавливаются» антитела, которые связались с ВИЧ.

Для коронавируса 2019-nCoV такого рода тесты тоже скоро появятся — в Сингапуре их уже начали применять. Но заменой ПЦР-диагностике они стать не могут.

Дело в том, что на производство собственных антител организму требуется время. Достоверно выявить инфекцию таким методом можно только спустя три недели после заражения (да и тесты на ВИЧ рекомендуют повторить через несколько месяцев после возможного заражения, чтобы убедиться наверняка).

В этом тоже есть своя польза: с помощью антител можно будет определить тех, кто переболел вирусом бессимптомно или с легким недомоганием, не вызвавшим беспокойства. Именно так можно будет постфактум подсчитать, насколько на самом деле заразен новый коронавирус. Но ускорить процесс поиска тех, кто болен прямо сейчас, антитела никак не помогут.

Кроме того, не стоит забывать, что 20 минут или 2 часа — это время, необходимое прибору, чтобы выдать ответ. К ним надо прибавить время на транспортировку до ближайшего центра, где производят анализ.

Дальше учитываем рабочие графики персонала клиники, берущего пробу, и сотрудников лаборатории, осуществляющих анализ, — и в результате получаем те несколько дней, которые должны пройти, прежде чем человек узнает, заразился он коронавирусом или нет.

Хранители метода

Неизбежно возникает вопрос: неужели это настолько сложный анализ, что для него необходимы специальные лаборатории? Почему бы, например, не поставить приборы прямо в аэропорту, чтобы проверять людей на въезде в страну?

Ответ заключается в том, что, как бы просто ни выглядел метод ПЦР в реальном времени, для него нужны как минимум бокс для смешивания реактивов и амплификатор (прибор, способный циклически нагревать и охлаждать раствор, а также замерять интенсивность свечения), а они стоят недешево и требуют стерильности.

Но важнее то, что в каждой такой лаборатории должны быть праймеры — затравки для посадки ДНК-полимеразы. На самом деле тест-система — это просто пара праймеров, подобранных таким образом, чтобы связываться только с определенным участком коронавирусной ДНК и не реагировать ни на один другой вирус и тем более на ДНК человека.

Сейчас в России действуют две таких тест-системы: одна позволяет распознать только коронавирус, другая реагирует на последовательность, общую для коронавируса и вируса атипичной пневмонии SARS.

Разработкой этих праймеров в мире параллельно занимаются десятки лабораторий. Само по себе это не очень сложное занятие: в отличие от создания теста на антитела, для разработки праймеров достаточно только расшифрованного генома.

Информация о геноме появилась в сети уже 10 января, после чего любой специалист мог заняться поиском последовательности ДНК, уникальной именно для этого вируса. Дальше к ней надо подобрать подходящий праймер-затравку и проверить, что он стабилен и садится на ДНК при температурах, возникающих в ходе ПЦР.

«Такой тест за короткое время может сделать любой грамотный молекулярный биолог», — утверждает профессор вирусологии, заведующий лабораторией Всероссийского научно-исследовательского института экспериментальной ветеринарии Алексей Забережный.

«Но нужно доверить кому-то одному», — говорит он. В России этим избранником стал Государственный научный центр «Вектор» в Новосибирске. Саму тест-систему сотрудники «Вектора» создали буквально за одну-две неделие. Но снабдить ею все диагностические центры страны — куда более сложная задача.

«Понятно, что ни за неделю, ни за месяц они физически не смогут произвести эти тесты и распространить их по всей России, — объясняет Забережный. — Передать его за две тысячи километров за один день можно только по интернету».

Поэтому, по словам ученого, диагностическая лаборатория получает лишь последовательности праймеров и температуру реакции, а уже дальше может синтезировать их самостоятельно и запустить тестирование. Правда, отмечает Забережный, такая диагностика будет не вполне легитимна.

«Для валидации диагностики необходим физический положительный контроль (то есть образец вируса. — Прим. N + 1), а его ни у кого не было. Если Роспотребнадзор привез положительные образцы в Новосибирск, то тогда я снимаю шляпу, тогда молодцы», — говорит ученый.

В то же время в других странах мира принято пересылать диагностическую тест-систему целиком, не оставляя ее сборку на откуп лабораторий. В комплект, как правило, входит и положительный контроль.

Издание «Медуза», получившее доступ к протоколу использования тест-системы, разработанному «Вектором», тоже упоминает использование положительного контроля — а значит, едва ли процесс ограничивается пересылкой последовательности праймеров по интернету.

Таким образом, ко времени, которое необходимо на проведение анализа, нужно добавить еще время на пересылку и получение тест-системы.

Однако главное препятствие в погоне за коронавирусом 2019-nCoV состоит даже не в том, что ловить его долго, и не в том, что это удовольствие не из дешевых, а в том, что не на каждом этапе болезни его можно достоверно поймать, даже если хотя бы по одному разу проверить всех жителей Земли (что совершенно нереально).

У метода ПЦР есть свои ограничения по чувствительности: он не способен выявить вирус, если в пробе меньше десятков или сотен копий его РНК. При таких концентрациях слишком мала вероятность, что праймеры и полимераза случайно «столкнутся» с нужной молекулой в растворе. Но как только концентрация вирусных геномов становится больше, появляются и первые симптомы болезни, которые и так заставляют нас быть настороже.

Таким образом, поймать вирус в первые моменты после заражения, чтобы изолировать всех его носителей, технически невозможно. И в нашей кажущейся беспомощности перед лицом эпидемии виноваты не только нехватка денег, медленное реагирование и несовершенство системы здравоохранения, но и — не в последнюю очередь — броуновское движение, мешающее праймерам выхватить редкий вирусный геном из разбавленной пробы бессимптомного носителя.


Мне кажется что материал интересен не столько модной темой коронавируса, сколько рассказом какими сложными и тонкими методами идентификации работает современная микробиология и какие сложности возникают при внедрении уже вполне понятного метода, доведенного до технологии, в реальную медицинскую практику, особено когда ситуация эпидемии и участвуют в процессе буквально миллионы людей.

Оставить комментарий



Архив записей в блогах:
В среду 20 февраля ВМС США заключили с Boeing $43-миллионный контракт на постройку четырех 15-метровых подводных аппаратов XLUUV, способных проходить под водой в автономном режиме до шести с половиной тысяч морских миль. Американские военные рассматривают возможность создания ...
В хуторе Крымский, что в Усть-Донецком районе, мы были уже раза три. Именно с него началось наше "увлечение" пешим туризмом. Места там очень красивые, возвышенности, поля, деревья и Сухой Донец. Глядя с высоты на эту красоту, просто дух захватывает. Но за прошлые поездки, в разное ...
Вчера в Лондоне состоялась премьера фильма Питера Джексона «Хоббит: Битва пяти воинств». Чтобы представить фильм, на красную дорожку вышли Мартин Фриман, Иэн МакКеллен, Бенедикт Камбербэтч, Ричард Армитедж, Ли Пейс, Орландо Блум, Эванджелин Лилли, Энди Серкис и другие звезды франшизы. ...
Помню такие посты уже были, но в отличие от большинства я меня свой рабочий стол чуть ли не каждый месяц. И все-таки сейчас лето и обычно хочется, чтобы обои отражали ваше настроение и говорили, что отдых не за горами.Так давайте посмотрим, что у ...
Le candidat à la présidentielle et ancien premier ministre, Dominique de Villepin, a estimé dimanche qu'il était "temps de réfléchir à une action sur le terrain" en Syrie, envisageant des frappes ciblées contre le régime de Bachar al-Assad. "Il est temps d'agir de façon déterminée, avec la Ligue arabe, pour créer une formation d'intervention humanitaire", a dit Dominique de Villepin, invité du Soir 3 . Как всегда, ...