Синергетический противовирусный эффект in vitro комбинаций ИВЕ, эфирных масел и

budetlyanin108 — 26.11.2023

Сочетание противовирусных препаратов с различными механизмами действия может помочь предотвратить развитие резистентности, воздействуя на инфекционный агент несколькими путями. Кроме того, используя более быстрые и экономичные методы скрининга, можно быстро идентифицировать эффективные синергические кандидаты на лекарственные препараты, что упрощает путь к клиническим испытаниям. В этой работе был стандартизирован быстрый метод выявления возможных синергизмов от комбинаций лекарственных средств. Мы проанализировали возможное снижение эффективной противовирусной концентрации препаратов, уже одобренных FDA, таких как ивермектин (IVM или ИВЕ), рибавирин (RIBA) и ацикловир (ACV) против вируса Зика (ZIKV), вируса Чикунгунья (CHIKV) и вируса герпеса типа 2 (ВГЧ-2). Эфирные масла (ЭМ) также были включены в исследование, поскольку уже более двух десятилетий сообщалось, что они обладают противовирусной активностью широкого спектра. Мы также продолжили изучение противовирусных свойств одной из наших запатентованных молекул с широким спектром противовирусной активности, аналога ферругинола 18-(фталимид-2-ил)ферругинола (phthFGL), IC99 которого составила 25,6 мкМ для трех типов вируса. В целом, комбинация IVM, phthFGL и ЭО орегано показала наибольший потенциал синергизма против CHIKV, ZIKV и HHV-2. Например, эта комбинация позволила снизить значение IC 99 каждого компонента до ~8, ~27 и ~12 раз для CHIKV соответственно. Тройная комбинация RIBA, phthFGL и ЭО орегано была немного более эффективной, чем бинарная комбинация RIBA/phthFGL, но гораздо менее эффективной, чем IVM, phthFGL и ЭО орегано, что указывает на то, что IVM может вносить больший вклад в дифференцировку клеточных мишеней (для например, посредством ингибирования гетеродимерного комплекса импортина IMP α/β1 хозяина), чем рибавирин. Статистический анализ показал значительные различия между протестированными комбинированными группами, особенно в моделях HHV-2 и CHIKV, с p = 0,0098. Кроме того, phthFGL продемонстрировал хороший фармакокинетический профиль, что должно стимулировать будущие исследования по оптимизации.

...

3. Обсуждение

Из-за высоких затрат, связанных с разработкой лекарств, существует необходимость поиска новых стратегий. Комбинированная лекарственная терапия является одной из таких новых стратегий борьбы с возникающими вирусными инфекциями, среди других типов заболеваний. Используя более быстрые и экономичные методы скрининга, можно быстро идентифицировать кандидатов с «эффективным синергизмом», что облегчает или обеспечивает более быстрый путь к клиническим испытаниям [ 26 , 27 , 28 , 29 ]. IVM является специфическим ингибитором импортин-α/β-зависимого комплекса ядерных транспортных белков (IMPα/β1) и демонстрирует потенциальную противовирусную активность против нескольких РНК- и ДНК-вирусов [2 , 3 , 4 , 5 , 6 ] . Например, противовирусное действие IVM на коронавирус объясняется следующим: во время репликации SARS-CoV-2 комплекс IMPα/β1 связывается с белками-грузами коронавируса в цитоплазме, транспортируя их через комплекс ядерных пор (NPC) в ядро ​​[ 2 , 6 ]. Там вирусные белки снижают противовирусный ответ клетки-хозяина, что приводит к усилению инфекции [ 2 , 3 , 4 , 5 , 6 ]. IVM диссоциирует предварительно сформированные гетеродимеры IMPα/β, которые необходимы для ядерного импорта белков коронавируса. Это предотвращает связывание IMPα/β1 с вирусными белками и проникновение внутрь ядра [ 6 , 36 ]. Кали и др. (2020) [ 2 ] протестировали противовирусную активность IVM против SARS-CoV-2 (изолят Australia/VIC01/2020) в клетках Vero/hSLAM при множественности заражения (MOI) 0,1 (48 hpi), в результате чего значение EC 50 составило ок. 2,0 мкМ [ 2 ]. Было показано, что высокие дозы IVM в 600 мкг/кг/день у людей вызывают максимальную концентрацию в плазме (Cmax) 120 нг/мл (~0,14 мкМ) [37], что намного ниже, чем его противовирусное значение in vitro . ~2 мкм [ 2 ]. Это может быть подтверждено симуляционными исследованиями, полученными с помощью математических моделей, согласно которым IVM достигает концентрации в легочной ткани, в три раза превышающей концентрации в плазме [ 37 ]. Однако 5-дневное лечение IVM в дозе 12 мг один раз в день у взрослых показало клиренс вируса у пациентов с SARS-CoV-2 через 9,7 дней по сравнению с 12,7 днями в группе плацебо [38 ]]. Более того, в клиническом исследовании с участием пациентов с денге (DENV4/45,2%, DENV3/33,9%, DENV2/8,7% и DENV1/7,0%) ежедневная пероральная доза 400 мкг/кг IVM также продемонстрировала тенденцию к снижению клиренса неструктурного белка 1 (NS1) в плазме на 3-й день по сравнению с плацебо, хотя клиническая эффективность при таком режиме дозирования не наблюдалась [ 39 ], хотя in vitro значения EC 50 IVM для DENV/1-4 варьировались от 1,6 до 2,3. мкМ в клетках BHK-21 (48 hpi) [ 40 ]. На сегодняшний день остаются разногласия относительно применимости IVM в качестве противовирусного лечения широкого спектра действия из-за его низких уровней в плазме, достигаемых при пероральном приеме. По этой причине синергизм комбинаций лекарств может быть вероятной альтернативой [ 41 , 42 ], а также инновациями в способах введения (например, составами назальных спреев [ 43 ]) для повышения его эффективности.

В этом исследовании мы стандартизировали быстрый метод выявления возможных синергизмов от комбинаций лекарств, анализируя возможное снижение эффективной противовирусной концентрации IVM и других молекул-кандидатов, уже одобренных FDA. ЭО были включены в исследование, поскольку уже более пары десятилетий сообщалось, что они обладают противовирусной активностью широкого спектра [ 8 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 ]. В экспериментах мы добавили одну из наших запатентованных молекул с продемонстрированной противовирусной активностью широкого спектра in vitro [ 20 ], производный от абиэтана аналог 18-(фталимид-2-ил)ферругинол (phthFGL) ( 1a , рисунок 1 ), как продолжение наших исследований этой «чудо-молекулы». В свете настоящего исследования получены доказательства противовирусной активности широкого спектра действия (против ZIKV, CHIKV и HHV-2) различных комбинаций трех молекул (IVM, RIBA и phthFGL) и двух эфирных масел (орегано и фенхеля). IVM уже продемонстрировал активность против ZIKV и CHIKV [ 6 , 44 ]. Мы обнаружили значение IC 99, составляющее ок. 1,2 мкг/мл (1,37 мкМ) для ZIKV в период 48 hpi (10 TCID50/~MOI= 1). Кроме того, Варгезе и др. (2015) [ 44 ] сообщили о значении анти-CHIKV IC 50 , равном 0,6 мкМ в клетках BHK-21 при 16 hpi/MOI = 0,01, тогда как полученное нами значение CHIKV IC 99 составляло 1,8 мкг/мл (2,1 мкМ). Насколько нам известно, IVM до сих пор не изучался в отношении HHV-2. В этом исследовании IVM был менее активен против HHV-2, чем против ZIKV и CHIKV. Слонска и др. (2013) [ 45 ] оценивали противовирусную активность IVM против двух штаммов вируса герпеса лошадей 1-го типа (Jan-E EHV-1 и Rac-H EHV-1), но была обнаружена только противовирусная активность против штамма Jan-E EHV-1. . Льв и др. (2018) также исследовали влияние IVM на репликацию вируса подсемейства альфа-Herpesviridae, такого как вирус псевдобешенства (PRV) [ 46 ]. Они обнаружили, что IVM в концентрации 2,5 мкМ нарушал ядерную локализацию PRV UL42 (дополнительной субъединицы ДНК-полимеразы PRV) в модели клеточной линии BHK-21, воздействуя на сигнал ядерной локализации белков, и снижал титры PRV более чем  7000 раз  через 48 часов после вирусной инфекции [ 46 ]. Дёнер и др. (2018) предполагают, что белок импортин α1 специфически необходим для ядерной локализации нескольких важных белков HHV-1, участвующих в таких процессах, как сборка капсида и выход капсида в цитоплазму [47 ] . В нашем исследовании мы обнаружили, что IVM обладает противовирусной активностью против HHV-2 в концентрациях ниже 3,2 мкМ, достигая примерно до 50% ингибирования. Наши результаты противовирусной активности IVM против HHV-2 позволяют предположить, что подсемейство альфа-Herpesviridae, HHV-2, использует ядерные носители для своих вирусных белков, как это было показано другими исследователями для родственных вирусов [ 45 , 46 , 47 ].

ФтФГЛ ( 1а , Рисунок 1 ) представляет собой производный абиэтана аналог (+)-ферругинола ( 1 , Рисунок 1 ), структурно похожий на коммерческий препарат экабет натрия ( 2 , Рисунок 1 ) [ 20 , 48 ]. На сегодняшний день экабет натрия является единственным коммерческим препаратом на основе дитерпеноидов абиетанового типа, который клинически используется при лечении гастрита и язвы желудка в Японии, поскольку он обладает высоким сродством к слизистой оболочке желудка, эпителиальным клеткам, альбумину и фибриногену в язве.  [ 48 ]. После однократного перорального приема таблетки динатрия экабета (1 г) добровольцы показали профиль максимальной концентрации в плазме во времени 4926 ± 880 нг/мл в первый час и период полувыведения из плазмы 6,63 ± 2,24 часа [48, 49 ] . ]. Между тем, для ферругинола ( 1 , рисунок 1 ) были проведены фармакокинетические исследования на крысах, достигших максимальной концентрации в плазме 3140 нг/мл через 40 минут после перорального введения в дозе 20 мг/кг (~1 г у взрослых) и период полувыведения из плазмы 41,73 минуты [ 50 ]. Исследования сходства лекарств с помощью моделирования in silico, такие как правила Липински, показали, что и ферругинол, и phthFGL нарушают только одно правило, которое соответствует коэффициенту распределения (его значения составляют 6,41 и 7,08 соответственно, и он не может быть больше 5). [ 21 ]. Кроме того, прогнозирование токсичности методом in silico с использованием шкалы Госселина, Смита и Ходжа показало, что phthFGL обладает достаточно хорошим профилем безопасности при пероральном введении крысам [21 ] . Прогнозируемое значение LD 50 для phthFGL, выраженное как масса химического вещества на единицу массы тела, находилось в диапазоне 500 < LD 50 ≤ 5000 мг/кг, что является умеренно токсичным. Согласно руководству Организации экономического сотрудничества и развития (ОЭСР), он был отнесен к классу 4 [ 21 ]. В ходе различных исследований мы сообщили о противовирусной активности phthFGL против DENV-2 и HHV-2 [ 18 ], ZIKV [ 19 , 20 ] и CHIKV [ 20 ]. Эта интересная молекула демонстрировала значения EC 50 в диапазоне 1,0–20,0 мкМ для этих вирусов, в частности, 1,4 мкМ для DENV-2 и 19,2 мкМ для HHV-2 [ 18 ], 7,7 мкМ для бразильского штамма Зика (клинический изолят, IMT17). ) [ 19 ], 5,3 мкМ для COL345Si Zika, 6,3 мкМ для Zika_459148 и 9,8 мкМ для CHIKV [ 20]. Совсем недавно мы продемонстрировали, что он также активен в отношении человеческого коронавируса HCoV 229E (PHE/NCPV 0310051v), где было обнаружено значение IC 99 3,0 мкг/мл (6,9 мкМ) [ 21 ]. В экспериментальном плане этого исследования использовались двойные серийные разведения от 0,4 до 25,6 мкМ для phthFGL, в результате чего значения IC 99 составляли 25,6 мкМ для трех протестированных вирусов ZIKV, CHIKV и HHV-2. Неопубликованные исследования убедительно доказывают, что в противовирусном механизме действия phthFGL участвует нарушение трансляции вирусного полипротеина посредством изменения ремоделирования актина, а также других родственных клеточных и вирусных процессов, участвующих в образовании репликативного комплекса [18 , 22 ] .

ДеФорни и др. (2022) [ 51 ] оценили влияние комбинации IVM, ремдесивира (RDV) и азитромицина (AZI) на репликацию SARS-CoV-2 in vitro. В этом исследовании для проверки синергических концентраций была создана двумерная матрица из 49 различных комбинаций для количественной оценки синергических взаимодействий. Они смешали двукратные серийные разведения соединений с клетками Vero E6 (слияние ~70%) в 96-луночных аналитических планшетах; Через 1 час клетки инфицировали SARS-CoV-2 при множественности заражения MOI = 0,01. Эти исследователи обнаружили, что сочетание RDV и IVM приводило к более низким концентрациям, необходимым для достижения полного ингибирования (~IC 99 ), в частности, в 6 и 13 раз для RDV и IVM соответственно [ 51 ].

Аналогичным образом мы также использовали двукратные серийные разведения соединений (IVM и phthFGL, или ЭО орегано или фенхеля) и смешивали их с 10 TCID50 каждого вируса (CHIKV, ZIKV и HHV-2). Затем эти смеси добавляли в 96-луночные аналитические планшеты, когда клетки Vero E6 достигали слияния ~80%. Комбинация IVM и phthFGL привела к гораздо более низким значениям IC 99 , чем при однократном лечении или IVM в сочетании с эфирными маслами орегано или фенхеля. Комбинированный IC 99 IVM и phthFGL против HHV-2 составлял 1,2 ± 0,4 против >3,5 мкг/мл только при IVM ( рис. 3А ), тогда как для CHIKV IC 99 составлял 0,6 ± 0,2 мкг/мл против 1,8 ± 0,6. мкг/мл ( рис. 3 C), а для ZIKV IC 99 составлял 0,93 ± 0,3 против 1,2 ± 0,4 мкг/мл ( рис. 3 E) в этом режиме с комбинацией препаратов. Средства контроля синергизма, такие как RIBA и ACV, о которых сообщила Панчева и соавт., использовались для проверки результатов, полученных с помощью нашего собственного экспериментального плана [ 34 , 35 ]. RIBA и ACV оценивались против HHV-2 в качестве положительного контроля для модели «потенциирующего эффекта» синергизма, поскольку оба препарата демонстрируют дополняющие механизмы действия [34 , 35 ] . С одной стороны, известно, что ACV избирательно фосфорилируется тимидинкиназой, кодируемой вирусом простого герпеса (HHV), а затем клеточные ферменты катализируют превращение монофосфата ACV в его трифосфатную форму (ACV-TP) [52 ] . ACV-TP ингибирует синтез вирусной ДНК и приводит к инактивации ДНК-полимеразы, кодируемой HSV-1 [ 52 ]. С другой стороны, RIBA, среди других механизмов, ингибирует синтез гуанозинмонофосфата, что приводит к уменьшению внутриклеточного пула гуаниновых нуклеотидов (GTP и dGTP, природного аналога ACV-TP, [52]), что может объяснить его противовирусное действие  активность против ДНК- и РНК-вирусов [ 34 , 35 , 52 ]. В вирусной модели HHV-2 IC 99 для RIBA снижалась со 176 мкМ до 36,6 ± 10 мкМ при его сочетании с ACV, тогда как для ACV IC 99 снижалась с 6,6 мкМ до 1,3 ± 0,4 мкМ, что является ок. 5-кратный порог определения синергизма ( рис. 4А ). Панчева и др. (1991, 1990) обнаружили снижение IC 50 до 40 мкМ под действием RIBA в сочетании с ACV (1,1 мкМ) против HHV-1 [ 34 , 35 ], результаты, которые согласуются с тем, что мы получили в нашем экспериментальном плане для этих двух контрольных групп. Более того, RIBA в сочетании с phthFGL ( 1a ) снизила значение IC 99 со 176 мкМ до 51,3 ± 39 мкМ, в то время как для ACV значение IC 99значение снизилось с 6,6 мкМ до 1,87 ± 0,6 мкМ. Таким образом, наиболее благоприятной бинарной комбинацией для снижения значения IC 99 была комбинация, представленная 1a , даже когда ее оценивали вместе с RIBA (25,6 мкМ против 3,73 ± 1,19 мкМ). Экспериментальные исследования, проведенные нами [ 11 ] и другими исследователями [ 10 , 12 , 13 , 53 ], показывают, что ЭО мешают структурам оболочки вириона, маскирующим белки вирусной оболочки, необходимые для адсорбции и проникновения в клетку-хозяина. Медиуни и др. (2020) [ 53 ] обнаружили, что активность ЭО орегано против ВИЧ-1 логически зависит как от состава, так и от оболочки вируса. Анти-ВИЧ-1 активность основных компонентов ЭО орегано, карвакрола и его изомера тимола и их смесей, была объяснена как вирулицидная активность, при которой эти компоненты инактивировали сайт связывания вируса (гликопротеинсвязывающий пептид) вирусного gp120 с клеткой-хозяином. [ 53 ]. Карвакрол также изменяет долю холестерина, присутствующего в вирусной оболочке (или клеточных мембранах) [ 10 , 53 ]. Показано, что вирус модулирует метаболизм холестерина в ходе вирусного цикла, влияя на внутриклеточный гомеостаз холестерина [ 10 , 53 , 54 , 55 ]. Из предыдущего исследования противовирусной активности более тридцати ЭО из видов семейств Verbenaceae, Piperaceae, Poaceae, Lamiaceae, Lauraceae и Myrtaceae против вирусов ZIKV, DENV, CHIKV, HHV-2 и HHV-1, из которых только результаты против CHIKV были опубликованы [ 56 ], для настоящего исследования были выбраны ЭО орегано и фенхеля. ЭМ Origanum vulgare (орегано) и Foeniculum vulgare (фенхель) от компании doTERRA продемонстрировали вирулицидную активность с противовирусными свойствами широкого спектра действия. На основании этого было решено включить ЭО в наши исследования синергизма.

В этом исследовании комбинация IVM, phthFGL и ЭО орегано показала наибольший потенциал синергизма с более высокими значениями для CHIKV, чем для ZIKV и HHV-2, что привело к снижению значения EC 99 до ~8 и ~27 раз для IVM и phthFGL соответственно, тогда как для ЭО орегано снижение составило ~12 раз. Потенциал синергизма, проявляемый ЭО орегано, можно объяснить высоким содержанием в нем карвакрола. Как объяснялось выше, карвакрол вытесняет молекулы холестерина в клеточной мембране [ 53 ]. ЭО действуют непосредственно на дыхательную, кровеносную и центральную нервную системы через кожу и дыхательные пути, а введение в форме спрея недавно рассматривалось как новая стратегия терапевтического применения ЭО [57 ] . Недавно было показано, что назальное введение спрея IVM на модели свиней позволяет достичь высоких концентраций препарата в тканях носоглотки, первичном месте проникновения/репликации вируса. [43 ] . В этом исследовании мы продемонстрировали синергизм компонентов IVM, phthFGL и ЭО орегано, которые действуют посредством различных механизмов действия против CHIKV, ZIKV и HHV-2 in vitro.

Сравнение параметров фармакокинетики, смоделированных с помощью веб-сервера SWISSADME, для phthFGL ( 1a , рисунок 1 ) и коммерческого препарата экабет натрия ( 2 , рисунок 1 ) демонстрирует схожие и хорошие характеристики сходства с лекарственным средством (см. дополнительные материалы, рисунки S1 и S2 ). Это подтверждает, что phthFGL является хорошим ведущим кандидатом для разработки новых противовирусных препаратов широкого спектра действия, что стимулирует дальнейшие исследования по улучшению физико-химических свойств соединения (растворимость, pH = 7,4 <0,1 мкг/мл). Фактически, мы проверили хороший фармакокинетический профиль phthFGL посредством исследований ADME in vitro ( таблицы S1 и S2, Дополнительные материалы ), следуя стандартным методам, о которых сообщалось ранее, и используя различные известные препараты в качестве контроля [ 58 ].

5. Выводы

Арбовирусы и респираторные вирусы могут вызывать очень схожие клинические симптомы в первые дни заболевания, затрудняя клиническую диагностику медицинскими работниками, создавая проблемы для надлежащего и раннего ведения случаев, а иногда и провоцируя фатальные события. Использование ЭО в качестве противовирусных препаратов имеет ряд ограничений, таких как отсутствие знаний о точном механизме действия, высокая летучесть, определенная нестабильность, которая затрудняет создание лекарственных форм, а также высокая липофильность, приводящая к низкой растворимости в биологических жидкостях и, следовательно, к низкой биодоступности [8 ] . Основное преимущество комбинаций лекарств заключается в том, что при наличии синергетического эффекта дозировка снижается и, следовательно, возникает меньше побочных эффектов, хотя последние могут усиливаться за счет взаимодействия между лекарствами. Еще одним преимуществом является то, что если компоненты комбинации препаратов имеют разные механизмы действия, то механизмы резистентности снижаются. Исследования комбинаций лекарств с противовирусной активностью широкого спектра, описанные в этом отчете, обеспечивают шаг на пути к более эффективным лекарствам против заболеваний, вызываемых новыми вирусами. В будущем дальнейшие исследования взаимодействия лекарств с коммерчески доступными лекарствами позволят людям быстро принимать некоторые лекарства дома в течение нескольких дней, чтобы предотвратить тяжелое заболевание, прежде чем их обратит на себя государственная система здравоохранения. В этой работе мы продемонстрировали, что тройная комбинация IVM, ЭО орегано и аналога ферругинола, а именно phthFGL ( 1a ), наделена весьма многообещающими противовирусными свойствами, снижая в несколько раз дозировку независимых компонентов, необходимую для достижения аналогичного противовирусного эффекта. Статистический анализ показал очень значимые результаты, особенно для моделей герпеса и CHIKV. Однако для достижения нормированного практического применения могут потребоваться дополнительные исследования по сравнению с обычной разработкой одного препарата. Продолжение исследований в этой области имеет решающее значение для улучшения нашей способности реагировать на возникающие вирусные угрозы [ 62 ].

Synergistic In Vitro Antiviral Effect of Combinations of Ivermectin, Essential Oils, and 18-(Phthalimid-2-yl)ferruginol against Arboviruses and Herpesvirus

Combining antiviral drugs with different mechanisms of action can help prevent the development of resistance by attacking the infectious agent through multiple pathways. Additionally, by using faster and more economical screening methods, effective synergistic drug candidates can be rapidly...

www.mdpi.com

Оставить комментарий

Популярные посты:

fogrant

Грузчики в Новосибирске: профессиональные услуги для ваших переездов

nathoncharova

Почему рыжеволосые ощущают боль не так как остальные

colonelcassad

Главный борец с Пашиняном

gull_25

Что сказали живые о полумертвом Джо

foto_history

Лос Анжелес, 1964

labana

Minsk never sleeps (почти цэ)

kompromatru

Цивилизованный инфантильный мужчина думает, что он "хороший"...

matsam

Утреннее

nathoncharova

История одного памятника, или Как англичане казнили за шпионаж обезьяну

• Ранее
• Архив