Станция «Вакцинная». Платформа «мРНКовая»

prof_afv — 18.01.2023

Прошлый пост на достаточно специальную тему, касающуюся разработки мРНК вакцин, вызвал больший читательский интерес, чем я рассчитывал. И мне показалось, что есть смысл немного развить тему, сделав это в более лаконичной форме, чем в предыдущих постах, посвящённых истории мРНК вакцин (https://prof-afv.livejournal.com/124905.html и https://prof-afv.livejournal.com/124962.html ). Что я и делаю.

Для широкой публики мРНК вакцины как будто бы с неба свалились, вскоре после начала пандемии COVID-19. На самом же деле этому научному направлению уже более 30 лет. Сама идея крайне проста и лежит на поверхности – если «ввести» в клетку мРНК, кодирующую протективный белковый антиген, то клеточная машина синтеза белка (рибосомы, тРНК, соответствующие ферменты и факторы) начнёт производить этот чужеродный белок. Затем он будет распознан иммунной системой и запустятся иммунные ответы. Если повезёт, они будут проективными (т.е. защищающими от соответствующего заболевания).

В 1987г. было впервые показано, что синтетическую мРНК можно ввести в клетки, «упаковав» её в липосомы, и что это запускает в клетках синтез белка, кодируемого данной мРНК. Но первые попытки таким образом «включить» иммунные ответы на белок, кодируемый синтетической мРНК, оказались безуспешными. А в 1990е годы это направление совсем заглохло. «Виновником» была ДНК. Оказалось, что внутримышечное введение ДНК, кодирующей белок, способно вызывать иммунный ответ на этот белок. Многим показалось, что до вакцин один шаг – сделать ДНК, кодирующую тот или иной белковый протективный антиген и «вакцина готова».

Все, кто имел дело с нуклеиновыми кислотами хорошо знают, что работать с РНК намного сложнее, чем с ДНК. Связано это, главным образом с тем, что РНКазы (ферменты разрушающие РНК) «витают» повсюду и от них очень трудно избавиться. А ДНК это довольно «неприхотливые» молекулы и ДНКазы, в отличие от РНКаз, экспериментаторам сильно не мешают. Какой же смысл «нянчиться» с мРНК, если всё то же самое, как казалось, можно сделать с ДНК. К тому же у РНК, как инъекционного препарата, обнаружилась крайне неприятная особенность – она вызывает сильные воспалительные реакции. «Расследование» показало, что в их основе лежит innate иммунный ответ, который инициируется связыванием РНК с Toll-like receptor 7 (TLR-7). C ДНК таких проблем нет. На какое-то время исследования ДНК-вакцин почти полностью вытеснили таковые РНК-вакцин. Однако до недавнего времени, несмотря на сотни, если не тысячи работ, посвящённых ДНК вакцинам, до уровня медицинского применения не дошла ни одна из них. (Правда, есть одно исключение – индийская ДНК вакцина против COVID-19, В Индии, и только там, она разрешена национальным регулятором. Насколько эта вакцина эффективна не ясно и широко она не применяется, если применяется вообще, даже в Индии).

Разочарование в ДНК-вакцинах усиливалось. Тем временем на поле мРНК вакцин, наметились прорыв. Был найден эффективный способ «погасить» чрезмерную воспалительную реакцию на внутримышечное введение РНК. Суть открытия состояла в том, что если в мРНК заменить уридин на псевдоуридин (редко встречающийся в мРНК аналог уридина), то это не только не мешает эффективному считыванию белка с такой мРНК, но и очень существенно тормозит воспалительную реакцию на введение мРНКового препарата. Соответствующая статья была опубликована в 2005г.

Помимо этого, были разработаны и другие биоинженерные «трюки» (оптимизация кодонов, модификации «шапочки» и нетранслируемых областей мРНК, удлинение поли-А хвоста и др.), которые позволили значительно повысить эффективность трансляции (т.е. считывание белка) с синтетических мРНК.

Параллельно совершенствовались способы доставки синтетических мРНК в клетки. Липосомы для этого оказались неэффективными. Проблема была решена с помощь липидных наночастицы - LNP (Lipid Nano Particles). LNP это малюсенькие липидные «шарики», в которых липиды частично заполняют «внутренность», где они как бы «окутывают» молекулы РНК. В этом их основное отличие от липосом, в которые внутренность заполнена водой. Чем меньше воды в шарике, тем лучше сохранность РНК. Поверхность же LNP состоит из одного слоя липидных молекул (у липосом два слоя липидов). Такая конструкция LMP позволяет достаточно надежно защитить РНК от РНКаз и, в тоже время, обеспечивает эффективное слияние с клеточной мембраной и проникновение мРНК в клетки.

Вообще-то сфера применения LNP технологии значительно шире мРНК вакцин. Ведь на основе РНК возможны и другие классы медицинских препаратов. Но так получилось, что именно в области мРНК вакцин технология LNP пока наиболее востребована.

Базовая «рецептура», на основе которой сделаны LNP всех современных мРНК вакцин, включает 4 ингредиента:

1) ионизируемый катионный липид

2) комплекс липида с полиэтиленгликолем (PEG)

3) нейтральный фосфолипид

4) холестерин.

Первый из этих компонентов наиболее важен – именно этот липид «обволакивает» молекулу РНК внутри LNP. Остальные ингредиенты обеспечивают структурную «жесткость» частиц и предотвращают их «слипание». Конкретные рецептуры основных мРНК вакцин не являются секретом. Для примера, ниже рецептура LNP вакцины Moderna:

1. Heptadecan-9-yl 8-((2-hydroxyethyl) (6-oxo-6-(undecyloxy) hexyl) amino) octanoate)

2. Monomethoxypolyethyleneglycol-2,3-dimyristylglycerol – PEG2000

3. 1,2-Distearoyl-sn-glycero-3 phosphocholine

4. Холестерин

Соотношения компонентов: 50:10:38.5:1.5

Но знать ингредиенты и пропорции смеси недостаточно. Есть ещё «маленькие» хитрости. Это, например, очень важна для масштабирования производства мРНК вакцин. Выяснилось, что воспроизводимые LNP получаются если смешивание липидов (растворённых в этаноле) и мРНК (растворённой в буферном растворе с кислым pH) происходит при столкновении встречных потоков этих компонентов. К 2020г. оборудование для производства LNP, нагруженных мРНК уже было готово и использовалось основными игроками в этой области.

Таким образом, область мРНК вакцин созрела для того, чтобы «выстрелить». И триггером стал COVID-19. В разработку вакцин против COVID-19 были брошены огромные ресурсы. Были такжн упрощены регуляторные процедуры. Нужно сказать, что создание прототипа вакцины — это самое простое и быстрое дело. Например, у Moderna на это ушло около около недели с момента обнародования китайскими исследователями генома SARS-CoV-2. Узким же звеном были, есть и останутся клинические испытания. И это касается всех вакцин, независимо от того на какой платформе они сделаны.

Проф_АФВ

Сохранено