Металлошапероны цинка как реактиваторы мутантного p53: новая парадигма в

budetlyanin108 — 04.02.2025

Восстановление структуры и функции дикого типа мутантного p53 с помощью небольшой молекулы (далее именуемой «реактивацией» мутантного p53) является одним из святых Граалей в терапии рака. Большинство мутаций TP53 являются миссенс-мутациями, которые генерируют дефектный белок, на который можно воздействовать. В настоящее время мы разрабатываем новый класс мутантных реактиваторов p53, называемых цинковыми металлошаперонами (ZMC), и здесь мы рассматриваем наше текущее понимание их. Белку p53 требуется связывание одного иона цинка, координируемого четырьмя аминокислотами в домене связывания ДНК, для правильной структуры и функции. Потеря структуры дикого типа из-за нарушения связывания цинка является распространенным механизмом инактивации p53. ZMC реактивируют мутантный p53, используя новый двухкомпонентный механизм, который включает восстановление структуры дикого типа путем восстановления связывания цинка и активацию p53 посредством посттрансляционных модификаций, вызванных клеточными активными формами кислорода (ROS). Первый вызывает изменение конформации дикого типа, второй запускает опосредованную p53 апоптотическую программу для уничтожения раковой клетки. ZMC — это хелаторы ионов металлов с малыми молекулами, которые связывают цинк и другие двухвалентные ионы металлов достаточно прочно, чтобы удалить цинк из сывороточного альбумина, но достаточно слабо, чтобы передать его мутантному p53. Недавно мы расширили наше понимание механизма ZMC до роли реакции клеток на этот всплеск цинка. Мы обнаружили, что клеточные механизмы гомеостаза цинка, которые обычно функционируют для поддержания свободного внутриклеточного уровня цинка в пикомолярном диапазоне, индуцируются ZMC. Нормализуя уровень цинка, они функционируют как выключатель ZMC, поскольку уровень цинка больше не достаточно высок для поддержания структуры дикого типа. Этот выключатель приводит к временной природе механизма ZMC, в котором активность мутантного p53 включается через несколько часов, а затем выключается. Это открытие имеет важные последствия для переноса ZMC в клинику, поскольку оно указывает на то, что концентрации ZMC не обязательно должны поддерживаться на высоком уровне для их активности. Действительно, мы обнаружили, что короткие экспозиции (всего 15 мин) были достаточны для наблюдения за реактивирующей активностью мутантного p53. Этот механизм переключения дает преимущество перед другими целевыми терапевтическими средствами в том, что эффективность может быть достигнута при минимальном воздействии, что минимизирует токсичность и максимизирует терапевтическое окно. Этот механизм переключения вкл/выкл уникален в целевых терапевтических средствах для лечения рака и повлияет на дизайн клинических испытаний на людях.

1.1 Многофункциональная роль p53
Ген TP53 является наиболее часто мутирующим геном во всех видах рака у человека, по крайней мере 50% раковых заболеваний несут мутацию, что частично объясняет, почему белок p53 является одним из наиболее интенсивно изучаемых факторов транскрипции [ 1 ]. В дополнение к своей роли как мощного супрессора опухолей, p53 стал пониматься как критически важный ответ на клеточный стресс широкого спектра этиологии, включая повреждение ДНК, активацию онкогенов и активные формы кислорода [ 2 ]. В нормальных клеточных условиях уровни p53 находятся под очень жестким контролем из-за отрицательной обратной связи с участием MDM2, E3-убиквитинлигазы и гена-мишени p53, который маркирует p53 для протеасомной деградации. Белок p53 в первую очередь регулируется на посттрансляционном уровне посредством посттрансляционных модификаций (ПТМ) p53, включая, помимо прочего, фосфорилирование, ацетилирование, метилирование, диметилирование, моноубиквитинирование, полиубиквитинирование, СУМОилирование и АДФ-рибозилирование [ 3 ]. Эти модификации регулируют функцию p53, влияя на его стабилизацию, а также на его связывание с промоторами различных целевых генов.

1.2. Мутации p53 и рак: уникальный супрессор опухолей
Белок p53 состоит из трех основных доменов: N-концевой домен, содержащий домен активации транскрипции (TAD, остатки 1–94); ДНК-связывающий домен (DBD, остатки 94–292); и C-концевой домен тетрамеризации (TAT, остатки 292–393) [ 6 ]. Большинство мутаций TP53 (75 %) являются миссенс-мутациями, при которых производится дефектный белок, который отличается от других супрессоров опухолей, таких как RB1 , APC и PTEN , которые обычно являются нулевыми мутациями [ 7 , 8 ]. Девяносто пять процентов миссенс-мутаций происходят в пределах ДНК-связывающего основного домена (DBD) [ 8 ]. Многие миссенс-мутации p53 увеличивают свободную энергию белка, что приводит к дестабилизации его структуры [ 9 ]. Интересно, что существует группа миссенс-мутаций, которые встречаются гораздо чаще других и известны как остатки «горячих точек», включающие R248, R273, R175, G245, R249 и R282 [ 10 ]. В настоящее время неясно, почему именно эти кодонные участки выбираются во время прогрессирования опухоли.Миссенс-мутации в p53 могут либо ослабить, либо полностью отменить активность дикого типа p53. Поскольку p53 функционирует как тетрамер, мутантный p53 может также функционировать как доминантный отрицательный ингибитор по сравнению с любым оставшимся диким типом p53 [ 11 ]. Наиболее общепринятое объяснение того, почему миссенс-мутации выбираются во время прогрессирования опухоли, исходит из концепции, что эти миссенс-мутантные белки функциональны и придают опухоли более благоприятную биологию несколькими способами. Эта концепция обычно известна как фенотип усиления функции мутантного p53 (GOF). Эта концепция была впервые предложена, когда мутантный p53 был введен в клетки с нулевым p53 и были обнаружены новые фенотипы (повышенный онкогенный потенциал у голых мышей и повышенная эффективность посева в культуре клеток агара) [ 12 ]. Эта концепция дополнительно подтверждается наблюдением, что у пациентов, несущих миссенс-мутацию TP53 зародышевой линии для мутантного белка p53, рак развивается значительно раньше, чем у пациентов, несущих нулевые мутации TP53 [ 13 ]. Аналогичным образом, у мышей, экспрессирующих мутантный p53, развивается рак, который является более метастатическим и агрессивным, чем рак, наблюдаемый у мышей с нулевым p53 или диким типом [ 11 ]. В то время как большинство мутаций p53 происходит в остатках «горячей точки», мутации почти в каждом кодоне ДНК-связывающего домена p53 наблюдались при раке. Накапливающиеся данные свидетельствуют о том, что широкий спектр мутаций p53 имеет различные последствия в отношении потери активности дикого типа, способности ингибировать оставшуюся функцию белка дикого типа и приобретения GOF [ 11 ].Другим свойством GOF мутанта p53 является повышение регуляции генов, регулирующих хроматин, что приводит к увеличению метилирования и ацетилирования по всему геному [ 14 ]. В частности, мутантные белки p53 управляют экспрессией метилтрансфераз KMT2A ( MLL1 ) и MKT2D ( MLL2 ) и ацетилтрансферазы KAT6A ( MOZ или MYST3 ). Опухоли, полученные от пациентов, экспрессирующие мутанты GOF p53, демонстрируют повышение регуляции MLL1 , MLL2 и MOZ , тогда как опухоли дикого типа или p53 null этого не демонстрируют. Эти генетические изменения способствуют пролиферации раковых клеток и могут быть ослаблены путем снижения MML1 или фармакологического ингибирования комплекса метилтрансферазы MLL1 [ 14 ].Мутации зародышевой линии в TP53 связаны с синдромом Ли-Фраумени, наследственным состоянием повышенной предрасположенности к развитию нескольких типов рака [ 15 ]. Интересно, что среди бразильских пациентов с синдромом Ли-Фраумени, по-видимому, наблюдается сильный отбор для миссенс-мутации R337H [ 16 , 17 ]. В отличие от мутаций горячих точек, которые все кластеризуются в пределах DBD, эта мутация происходит в домене олигомеризации и нарушает димеризацию в зависимости от pH [ 18 ].В большинстве опухолей, несущих дикий тип p53, существуют альтернативные механизмы для инактивации супрессора опухоли. Например, многие ДНК-онковирусы продуцируют белки, которые инактивируют p53, включая: большой T-антиген SV40, белок аденовируса E1B-55-kDa и онкопротеин E6 вируса папилломы человека (HPV) типов 16 и 18 [ 19 ]. Кроме того, опухоли могут отменять активность дикого типа p53 путем повышения регуляции отрицательных регуляторов p53. Было показано, что Mdm2 и его гомолог Mdmx повышаются в некоторых опухолях [ 20 ].Мутации в p53 нарушают консенсусное связывание ДНК и правильное сворачивание белка. Одним из последствий этого является потеря MDM2-опосредованной деградации мутантного белка. В результате уровни мутантного p53 очень высоки в раковой клетке и, таким образом, теоретически могут служить фармакологической мишенью. Восстановление функции дикого типа этих мутантных белков с использованием малой молекулы стало предметом интенсивных исследований в области развивающей терапии. Было описано множество подходов, многие из которых были открыты за последние десять лет и обобщены в нескольких обзорах [ 2 , 21 , 22 ].

1.3 Классы мутаций p53
Мутации в p53 можно в целом классифицировать как ДНК-контактные, структурные/стабильные или цинк-связывающие [ 23 ]. ДНК-контактные мутации, такие как p53-R273H, имеют замены аминокислот в остатках, которые напрямую взаимодействуют с ДНК. Хотя ДНК-контактные мутации не изменяют значительно структуру p53 [ 24 ], они могут влиять на термостабильность белка, измеряемую по температуре плавления [ 25 ]. Напротив, структурные или стабильные мутанты часто встречаются в гидрофобном ß-слое и заменяют аминокислоты, которые нарушают сворачивание основного домена [ 9 , 24 ]. Структурные мутанты сильнее снижают термостабильность белка и сильнее искажают структуру белка [ 25 ].Мутации связывания цинка классифицируются на основе их близости к петлям, участвующим в координации одного иона цинка [ 26 ]. Ион цинка координируется четырьмя аминокислотами (Cys-176, His-179, Cys-238 и Cys-242). Петли L2 и L3 DBD стабилизируются этим ионом цинка [ 6 ]. Мутации в любой из этих четырех аминокислот ухудшают связывание цинка и, таким образом, нарушают сворачивание белка (например: C176F, H179R, C238S, C242S) [ 6 ]. Наиболее хорошо изученным мутантом связывания цинка является R175H, который является наиболее часто встречающейся миссенс-мутацией p53 при раке [ 10 ]. Мутация R175H нарушает связывание цинка, что приводит к неправильному сворачиванию белка, а также к потере способности различать консенсусную и неконсенсусную последовательность ДНК [ 27 ].

1.4 Связь между структурой/функцией p53 и цинком
Идея о том, что структура мутантного белка p53 с дефицитом цинка может быть восстановлена ​​до дикого типа путем восстановления связывания цинка, подчеркивается ранними исследованиями взаимосвязи p53 с цинком. В частности, было обнаружено, что структура p53 может изменяться путем манипулирования концентрациями цинка в клетках. Другими словами, p53 может быть смещен в неправильно сложенную форму посредством хелатирования цинка, и это обратимо посредством добавления цинка [ 28 ]. Кроме того, истощение гомеодомен-взаимодействующей протеинкиназы 2 (HIPK2), активатора апоптоза, опосредованного p53, и отрицательного регулятора экспрессии металлотионеина, приводит к неправильному сворачиванию p53 дикого типа и принятию «мутантно-подобной» конформации [ 29 , 30 ]. Металлотионеины представляют собой семейство цитозольных цинксвязывающих белков, и их сверхэкспрессия из-за потери HIPK2 приводит к хелатированию клеточного цинка [ 31 ]. Добавление цинка в клетки с истощенным HIPK2 приводит к восстановлению структуры и функции p53 дикого типа, включая консенсусное связывание ДНК и транскрипцию генов-мишеней p53 [ 30 , 31 ]. Кроме того, в линиях раковых клеток человека, несущих p53-R175H (SKBR3) и R273H (U373MG), мутантный белок может быть рефолдирован посредством добавления ZnCl2 [ 32 ] . Кроме того, рефолдированный p53 приобрел функцию p53 дикого типа, включая связывание ДНК и транскрипцию генов-мишеней p53.

1.5. Открытие тиосемикарбазонов как мутантных реактиваторов p53
Металлошапероны цинка (ZMC) были идентифицированы с помощью скрининга базы данных Национального института рака (NCI) для веществ, которые преимущественно ингибировали рост линий раковых клеток человека, экспрессирующих мутации hotspot TP53 в кодонах 175, 248 и 273, по сравнению с клетками, экспрессирующими p53 дикого типа [ 33 ]. Подход in silico идентифицировал несколько тиосемикарбазонов, которые сильнее влияли на клетки, экспрессирующие одну из трех мутаций hotspot, но соединение NSC319726, позже переименованное в ZMC1, было наиболее мощным. ZMC1 индуцировал апоптоз зависимым от p53-R175H образом и индуцировал изменение конформации дикого типа в мутантном белке. Изменение конформации дикого типа совпало с повышением экспрессии p21, гена-мишени p53. Критически важным наблюдением был временный характер активности ZMC1, измеренный по уровням мутантного белка p53. ZMC1 был способен ингибировать рост ксенотрансплантированных опухолей мышей, полученных из линий клеток человека, экспрессирующих p53-R175H, но не опухолей из линий клеток, экспрессирующих дикий тип p53 или p53-R273H.Первая подсказка о том, что механизм ZMC1 зависит от цинка, была обнаружена в оригинальной публикации, идентифицирующей NSC319726. Тиосемикарбазоны уже были известны как хелаторы для железа, меди и цинка [ 34 ], однако цинк является единственным ионом, необходимым для правильного сворачивания p53 [ 26 , 27 ]. Добавление ZnCl2 в узком диапазоне (5–15 мкМ) было способно увеличить активность ингибирования роста клеток ZMC1 в два раза [ 33 ]. Другой компонент механизма был также обнаружен, связанный со свойствами соединения в отношении активных форм кислорода (ROS). Известно, что тиосемикарбазоны хелатируют железо и вызывают окислительный стресс путем образования гидроксильных радикалов посредством химии Фентона [ 35 ].  Триапин — это тиосемикарбазон, который исследуется в клинических испытаниях фазы 2 в качестве противораковой терапии для миелопролиферативных новообразований, рака шейки матки и влагалища на поздней стадии и прогрессирующего немелкоклеточного рака легких [ 37 , 38 ]. ZMC2 и ZMC3, но не триапин, проявили активность цинкового металлошаперона [ 36 ]. ZMC2 и ZMC3 связывали цинк в диапазоне, подходящем для реактивации p53-R175H, тогда как триапин не связывал цинк. Кроме того, ZMC2 и ZMC3 продемонстрировали повышенную чувствительность в клеточных линиях p53-R175H, а триапин — нет [ 36 ]. Так же, как ZMC1 восстановил конформацию дикого типа и транскрипционную активность p53 в мутантном p53-R175H, ZMC2 и ZMC3 были способны вызывать те же изменения, тогда как триапин — нет [ 36 ]. В совокупности эти исследования показали, что не все тиосемикарбазоны функционируют как металлошапероны цинка. 

1.6. Выяснение нового механизма действия в терапии рака

Группа выдвинула гипотезу, что NSC319726 восстановил структуру и функцию дикого типа мутантного p53-R175H, функционируя для восстановления связывания цинка с мутантным белком путем отдачи цинка. Это новая концепция, поскольку ни одна малая молекула никогда не была показана для того, чтобы вызывать изменение конформации в белке путем восстановления связывания цинка. Они назвали такую ​​молекулу цинковым металлошапероном (ZMC). Это было основано на модели цинк-зависимого сворачивания и неправильного сворачивания p53, где одна молекула Zn 2+ должна быть связана с p53 в ДНК-связывающем домене (DBD) [ 27 , 40 ]. Сначала было обнаружено, что ZMC1 образует комплексы с Zn 2+ в соотношении 2:1 [ 41 ]. Затем было установлено, что ZMC1 не связывает p53-R175H напрямую, что стало неожиданным открытием. Это привело к гипотезе о том, что, возможно, соединение повышает внутриклеточную концентрацию цинка достаточно высоко, чтобы преодолеть связывание цинка K d p53-R175H. Чтобы продемонстрировать это, им нужно было измерить K d p53-R175H, что никогда ранее не делалось. Во время их попыток количественно оценить связывающее сродство Zn 2+ к DBD мутанта p53, они обнаружили, что мутант p53-R175H содержит два участка связывания цинка в ДНК-связывающем домене белка [ 41 ]. K d1 относится к сильному, нативному участку лигирования (измеренному примерно в 2 нМ), а K d2 относится к более слабому ненативному участку (оценивается примерно ≥ 1 мкМ). Это наблюдение подтвердило представление о том, что p53-R175H существует в апо (безцинковой) форме внутри клетки. Используя in vitro биофизические анализы, группа продемонстрировала, что ZMC1 способен отдавать цинк p53-R175H и вызывать изменение конформации дикого типа. Это было важно, поскольку это было прямым доказательством того, что молекула способна (с добавлением цинка) вызывать изменение конформации. Напротив, доказательства такого изменения существовали только в виде клеточных данных с использованием антител, специфичных для конформации, где нельзя было сделать вывод, что препарат напрямую вызывал изменение конформации (возможно, был задействован какой-то другой белок(и)).

Активность металлошаперона цинка ZMC1 применима к другим миссенс-мутациям p53 с нарушенным связыванием цинка. В то время как мутация R175H является как наиболее распространенной миссенс-мутацией p53 при раке, так и наиболее распространенным мутантом, связывающим цинк, другие миссенс-мутации попадают в эту категорию и поддаются повторной металлизации с помощью ZMC. Линии клеток, экспрессирующие p53-C176F (SK-PN-DW) и p53-C238S (LN-18), имели схожие значения EC50 с линиями клеток, экспрессирующими p53-R175H (TOV112D), а клетки, экспрессирующие p53-C242S (H841) и p53-C242F (H1755), были заметно более чувствительны к ZMC1. В совокупности эти данные расширяют потенциальную популяцию опухолей, которые можно лечить с помощью ZMC.

 Подводя итог, можно сказать, что механизм ZMC1 является двойным и основан на (1) буферизации цинка для восстановления связывания цинка и (2) индукции ROS для активации вновь рефолдированного белка. В частности, K d1 дикого типа p53 значительно ниже, чем K d1 или p53-R175H (~2 нМ). K d2 как дикого типа, так и мутантного p53-R175H составляет ≥1 мкМ. При физиологических концентрациях цинка дикий тип p53 связан с цинком (Holo), в то время как p53-R175H свободен от цинка (Apo). Это объясняет, почему p53-R175H неправильно сворачивается в физиологических условиях, в то время как дикий тип p53 сворачивается. Обработка ZMC1 увеличивает внутриклеточные концентрации цинка выше 2 нМ, так что мутант R175H связывает цинк и рефолдирует. Вторым компонентом механизма ZMC1 является индукция ROS, которая запускает активацию p53 через PTM ( Рисунок 1 [ 42 ]).

Рисунок 1.

1.7 Доклиническая трансляция ZMC

Недавно мы описали, как клеточные гомеостатические механизмы цинка влияют на фармакодинамику ZMC [ 44 ]. Ранее было показано, что фармакодинамическая активность ZMC1 является временной, что отражается в уровнях мутантных p53 и p21. Экспрессия белка p21 быстро увеличивается после обработки ZMC1, достигает пика через 6 ч и возвращается к исходному уровню через 12 ч. Похожая картина наблюдается для кинетики притока цинка, вызванного ZMC1. Уровни цинка быстро увеличиваются и достигают пика через 4 ч, прежде чем вернуться к исходному уровню через 8 ч. Важно, что временное увеличение цинка предшествует реактивации мутантного p53, а активность препарата (измеренная по уровням p21) падает сразу же после возвращения к гомеостатическим концентрациям цинка.

 В ответ на обработку ZMC1 клетки демонстрируют увеличение экспрессии экспортера ZnT1 и цитозольного цинксвязывающего белка MT1A [ 44 ]. Одновременно происходит снижение экспрессии импортера цинка ZIP10. Все эти три изменения направлены на противодействие выбросу цинка. Во всем наборе генов гомеостаза цинка 16 из 37 генов продемонстрировали значительные изменения экспрессии в ответ на обработку ZMC1. ZnT1 , ZnT2 , ZnT3 , ZIP1 , ZIP9 , MT1G , MT1X и MT2A были заметно индуцированы в клетках TOV112D в ответ на обработку ZMC1 с кинетикой, которая коррелировала с притоком цинка, вызванным ZMC1. Экспрессия ZnT4 , ZnT7 , ZIP3 , ZIP6 , ZIP7 , ZIP10 , ZIP11 и ZIP14 снизилась в ответ на приток цинка, вызванный ZMC1 [ 44 ].

Клеточная линия MT1A/MT2A KO имела более выраженное и продолжительное увеличение цинка в ответ на обработку ZMC1 [ 44 ]. Потеря экспрессии MT1A и MT2A нарушала способность клеток быстро реагировать на приток цинка. Увеличение продолжительности повышенных уровней цинка соответствовало увеличению продолжительности и интенсивности экспрессии p21, маркера реактивации p53. Аналогично, клетки MT1A/MT2A KO были примерно в три раза более чувствительны к ZMC1, чем родительские клетки.

В совокупности эти данные предполагают механизм «включения/выключения» регуляции ZMC в клетке. Эти данные относительно клеточного ответа на цинк в сочетании с предыдущими механистическими исследованиями, которые были выполнены, сформировали более полное и наиболее современное понимание механизма действия ZMC. В раковой клетке, экспрессирующей p53-R175H, мутацию p53 с дефицитом цинка, уровни Zn 2+ поддерживаются в пикомолярном диапазоне (10 −9 M). Ранее было определено, что K d цинка p53-R175H составляет приблизительно 2 × 10 −6 M [ 41 ], что объясняет, почему мутантный белок находится в своей форме Apo (без цинка) и неправильно сложен ( Рисунок 2 A). Обработка ZMC вызывает приток ионов Zn 2+ , повышая внутриклеточный цинк в 1000 раз до приблизительно 1,5 × 10 −5 M, что достаточно высоко, чтобы позволить цинку связываться в нативном сайте лигирования p53-R175H, что приводит к изменению конформации дикого типа (форма Holo). Всплеск цинка и изменение конформации мутантного p53 являются переключателем ВКЛ, который позволяет недавно рефолдированному белку функционировать как дикий тип p53, чтобы вызвать апоптоз ( рисунок 2 B,C). В ответ на массивный всплеск цинка активируются клеточные гомеостатические механизмы цинка, чтобы вернуть уровни цинка обратно к физиологически соответствующим уровням.  В результате клеточного гомеостатического ответа цинка уровень цинка снижается, и цинк больше не может связываться с p53-R175H, заставляя мутантный белок возвращаться в свою форму Apo (без цинка), эффективно отключая переключатель ( рисунок 2 D).

Рисунок 2.

Этот механизм включения/выключения уникален в терапии рака, и трансляция in vivo предполагает, что ZMCs может не нуждаться в максимальной или непрерывной дозировке для оптимальной эффективности. Если активность выключается в течение нескольких часов, то, возможно, воздействие, необходимое для создания этой активности, должно быть только кратковременным. С помощью серии анализов было обнаружено, что короткие воздействия ZMC1 (всего 15 минут) способны предотвращать рост в анализе образования колоний, и что короткие воздействия способны индуцировать экспрессию гена-мишени p53 p21 [ 44 ].

Недавно были проведены доклинические исследования ZMC1 с использованием генетически модифицированной мышиной модели рака поджелудочной железы KPC (Pdx-1-Cre; Kras G12D/+ ; p53 R172H/+ или p53 R270H/+ ), в которой концепция механизма переключения была транслирована in vivo [ 44 ]. В этой модели p53 R172H/+ является аллелем с дефицитом цинка (мышиный гомолог человеческого p53R175H и положительный контроль), а p53 R270H/+ является аллелем без дефицита цинка (мышиный гомолог p53R270H, отрицательный контроль). Фармакокинетические исследования показали, что ZMC1 достиг C max 2,4 мкМ (значительно выше концентрации, необходимой для реактивации мутантного p53) с AUC last 0,385 ч × мкМ и периодом полураспада 0,59 ч, что указывает на то, что соединение быстро выводится [ 44 ]. Такой фармакокинетический профиль обычно был бы невыгодным для традиционного таргетного терапевтического средства; однако для ZMC это оказалось преимуществом.  

1.8. ZMC, синтезированные в комплексе с цинком: новая лекарственная формула
Недавно мы синтезировали новую формулу ZMC1, в которой мономер синтезируется в комплексе с цинком в молярном соотношении 2:1 [ 44 ]. Мы назвали комплекс Zn-1. Мы предположили, что комплекс улучшит доставку цинка и, таким образом, будет более эффективным. Анализы ингибирования роста клеток показали, что Zn-1 на самом деле более эффективен, чем ZMC1. Используя ЖХ/МС/МС, мы смогли обнаружить как комплекс (Zn-1), так и его мономерные единицы (ZMC1) в сыворотке мышей, обработанных Zn-1. У мышей KPC-p53 R172H Zn-1 был более эффективным и менее токсичным, чем ZMC1. Аналогичным образом, обработка Zn-1 увеличила выживаемость мышей KPC-p53 R172H как по сравнению с контролем-носителем ( p = 0,00065), так и с мономером ZMC1 ( p = 0,023).

1.9 Фармакокинетические параметры, отличающие ZMC
Этот переключатель вкл/выкл имеет важные последствия для перевода ZMC в клинику. В то время как большинство целевых противораковых препаратов разработаны для специфического связывания молекулярной мишени в течение максимально возможного периода времени (например, ингибиторы киназы и блокаторы рецепторов), ZMC вообще не связывают свою молекулярную мишень (мутантный p53). Более того, традиционная парадигма в разработке целевых препаратов заключается в оптимизации соединений с помощью медицинской химии для фармакокинетических свойств (например, T 1/2 , AUC max ), которые максимизируют воздействие препарата, чтобы гарантировать, что молекула будет связана со своей целью как можно дольше. Все ZMC имеют некоторое сродство к другим двухвалентным ионам металлов, включая хелатирование окислительно-восстановительно активного железа и меди, что является источником токсичности. Переключатель вкл/выкл ZMC является значительным преимуществом, поскольку он позволяет осуществлять кратковременное воздействие, которое минимизирует токсичность. С фармакокинетической точки зрения ZMC не нужно оптимизировать для максимального воздействия, а скорее для достижения оптимальной максимальной концентрации (C max ) в сыворотке крови, чтобы увеличить внутриклеточную концентрацию цинка в достаточной степени для реактивации мутантного p53 (выше EC 50 опухолевой клетки).
1.10.1 Отбор пациентовПациентам необходимо будет провести секвенирование, чтобы определить статус p53 их опухолей и наличие у них мутации с дефицитом цинка. R175H, вероятно, будет наиболее распространенной мутацией в когорте, поскольку это самая распространенная миссенс-мутация p53, но другие мутации будут включены для расширения потенциального пула пациентов. Хотя наше исследование расширило спектр мутантов p53 с дефицитом цинка [ 41 ], полный спектр неизвестен. Мы предполагаем, что ряд других миссенс-мутантов в непосредственной близости от кармана связывания цинка также могут нарушать способность белка связывать цинк. Необходимы дальнейшие исследования, чтобы определить спектр миссенс-мутантов, которые могут быть реактивированы ZMC.
1.10.2 Клиническое испытание для подтверждения концепцииВ сегодняшнем высококонкурентном мире разработки целевых препаратов существует повышенная потребность в понимании не только того, является ли конкретный препарат безопасным, но, что более важно, есть ли доказательства того, что он может поразить свою цель. Таким образом, клинические испытания для подтверждения концепции занимают лидирующие позиции на ранних этапах клинической разработки. Мы считаем, что это должно также применяться к первому клиническому испытанию на людях с ZMC. В то время как большинство испытаний фазы I используют традиционное исследование эскалации дозы для определения максимально переносимой дозы (MTD), для ZMC MTD не является необходимым и вызовет нецелевую токсичность. Модуляции дозы будут определяться их уровнями C max , а конечной точкой будет соответствующий анализ реактивации мутантного p53 в опухоли. Мы обнаружили, что измерение транскрипционных мишеней p53 в качестве биомаркера активности является сложной задачей, и что маркеры апоптоза являются более оптимальными. Дополнительные конечные точки исследования будут включать уменьшение размера опухоли и безрецидивную выживаемость.
1.10.3 Биомаркеры чувствительности/резистентностиКак и в случае с любым противораковым лечением, будут и те, кто реагирует, и те, кто не реагирует. Мы обнаружили ([ 49 ]) механизм врожденной резистентности к ZMC в нарушении регуляции экспрессии генов гомеостаза цинка. Многочисленные исследования описали нарушение регуляции генов гомеостаза цинка при раке груди [ 50 ], поджелудочной железы [ 51 ] и простаты [ 52 ]. Раковые клетки, которые экспрессируют аномально высокие уровни генов, которые функционируют для снижения уровня цинка (например, металлотионеины), вероятно, ухудшат способность ZMC повышать уровень цинка достаточно высоко, чтобы реактивировать мутантный p53. Таким образом, на данный момент кажется, что высокая экспрессия металлотионеина является биомаркером резистентности к ZMC. В будущих клинических испытаниях, вероятно, пациенты также будут проходить скрининг на полный набор генов гомеостаза цинка, поскольку транскриптомное профилирование становится все более широко используемым.

2. Выводы
Металлошапероны цинка представляют собой новый фармакологический подход к реактивации мутантных белков p53 с дефицитом цинка. Значительный прогресс был достигнут в понимании механизма ZMC, указывающего на некоторые очень уникальные свойства в области терапии рака. В настоящее время существуют доклинические данные, демонстрирующие, как эти свойства могут быть транслированы in vivo. Теперь необходимы дальнейшие исследования для оптимизации ZMC1 для свойств, подобных лекарственным препаратам, чтобы найти молекулу, которую можно ввести в клинику. Недавно мы также обновили формулу ZMC1, синтезировав его в комплексе с цинком в соотношении 2:1 [ 44 ]. Доклинические данные с использованием генетически модифицированной мышино

Оставить комментарий

Популярные посты:

vespasianus

Топ-5 причин, почему стоит выбрать Adopt me! для торговли валютами

zet_isnotdead

Немного русский Оскар)

anna_bpguide

Ночь, улица, луна

masy_vibes

Только небо, только ветер, только радость впереди

grazdano4ka

«Оставляете меня одну на старости лет!» – рыдает свекровь

v_strannik

Ценные вещи

viking_nord

Кириенко

kompromatru

У военных экспертов-истеричек обоего пола никогда не бывает ничего хорошо

gelio

Зимние Синские столбы в Якутии

• Ранее
• Архив