Как я изучал туберкулезные бактерии

vakhnenko — 18.04.2020 Десять лет назад я работал в IT. Сейчас я тоже работаю в IT. Но в середине декады моя карьера выдала неожиданный зигзаг, и в течении нескольких лет я был микробиологом. В числе прочего, я занимался исследованиями туберкулеза в лаборатории с третьим уровнем биологической безопасности (далее "BSL-3"). Всего этих уровней четыре, подробнее про них можно прочесть тут, например. Вкратце, BSL-1 это самый травоядный уровень, а BSL-4 самый крутой, где изучают вещи вроде эболы. Третий уровень это чума, туберкулез, Западный Нильский вирус, коронавирус SARS, и т.п.

И решил вот написать пост про тот период в моей жизни -- с упором на повседневные реалии работы в лаборатории BSL-3. Думаю, это может быть многим интересно в силу нынешних обстоятельств, особенно учитывая официально прозвучавшие на этой неделе обвинения со стороны американской администрации, что -де коронавирус SARS-CoV-2 мог вырваться из китайской лаборатории в Ухани из-за небрежности тамошнего персонала.


Как я дошел до жизни такой?

Началось всё в 2014, когда мне до смерти наскучило то, чем я тогда занимался, и я решил кардинально изменить жизнь. Сказано-сделано, я подал несколько заявлений на поступление в магистратуру, и осенью того же года переехал из Вашингтона в Бостон. В начале учебы мне надо было выбрать в моем универе лабораторию в которой я буду делать диплом. Не буду долго бить себя копытом в грудь, но лабораторию занимающуюся конкретно туберкулезом я выбрал, дабы чуточку помочь моей исторической родине, ибо в России ситуация с тубиком довольно неприглядная, пусть и постепенно улучшающаяся. Магистратура моя была инженерной, но в той биологической лабе нужен был кто-то более-менее обученный статистическому анализу, моделированию, численным методам и основам программирования, так что я пришелся ко двору. Лаба на тот момент была совсем маленькая, всего четыре человека, так что кроме анализа данных я занялся и экспериментами, благо у меня уже был опыт работы в пару лабораторий, во времена моего бакалавриата.

Поначалу, правда, я работал не с туберкулезными палочками, а с бактериями M. smegmatis из того же семейства. У тех характеристики во многом схожи с туберкулезными бациллами, но при том уровень биологической безопасности для них всего лишь BSL-1, и размножаются они чуть ли не на порядок быстрей тубика (в благоприятных условиях деление раз в ~несколько часов, вместо ~дня) -- в общем, работать с ними не в пример легче. Вот мое тогдашнее рабочее место (плюс была общая на нашу лабу комната с микроскопами, и т.д.):



Разумеется, даже в BSL-1 надо озадачиваться стерильностью -- но в основном всё ограничивалось одноразовыми перчатками, протиранием рабочего места (либо 10% раствором отбеливателя, либо 70% раствором алкоголя), работой при включенной бунзеновской горелке (пламя вроде как создает небольшую сферу, где в воздухе болтается меньше микроорганизмов), и тому подобными мерами. К слову, нас сильно гоняли когда кто-то ходил по коридорам в обеих перчатках, ибо касаться перчаткой дверной ручки, которую потом другие трогают незащищенными руками -- серьезное нарушение техники безопасности.

Через какое-то время, моя начальница решила до кучи научить меня ставить эксперименты с самим туберкулезом, ибо с M. smegmatis у меня получились весьма интересные результаты. Статью за моим авторством даже получилось опубликовать в Вестнике академии наук США (PNAS), что для весьма недурно для инженеришки с магистратуры -- так что после этого возникло естественное желание провести тот же эксперимент с бактериями туберкулеза. Пришлось научиться работать в BSL-2 (например, экспериментируя над бактериями БЦЖ, которые используются в прививках против туберкулеза), и в BSL-3.

Входим в BSL-3

Театр начинается с вешалки, а наша BSL-3 лаборатория начинается с этого сканера отпечатка ладони. Вкладываешь магнитную карту-пропуск в прозрачный желоб на правой части сканера, прикладываешь ладонь к поверхности, и компьютер сравнивает картину электрического сопротивления ладони с тем, что у него заложено в памяти.



Магнитную карту (на которой есть имя и фотография) мы оставляли в специальной позрачной папке, висящей на внутренней стороны внешней двери -- чтобы было сразу понятно, есть ли кто-то внутри. По протоколу, надо было всегда держать в известности о своей работе в BSL-3 кого-то из членов нашей лаборатории, ибо зачастую ты в том помещении один, и сама BSL-3 при том находится на полупустом этаже. Так что если ближе к вечеру споткнешься и неудачно упадешь, то в лучшем случае найдут уже следующим утром. Более того, полиция или парамедики даже не имеют права туда входить, это должен делать кто-то, прошедший соответствующее обучение и имеющий доступ.

К слову, вид с того этажа небезинтересный:



После входа надо надеть защиту в эдаком "тамбуре". На схеме ниже тот отмечен цифрой 2 (а 1 это дверь, которая открывается отпечатком ладони). Пардон за низкое разрешение, лучше не нашлось.



Как надевать защиту, по порядку:

1) Надеваем одноразовые перчатки, доходящие примерно до середины запястья.

2) Надеваем костюм из тайвека, со вшитыми бахилами и капюшоном. Костюмы эти мы использовали по несколько раз.



3) Перчатки приматываются по окружности липкой лентой к рукавам костюма, чтобы во время работы не оголялись запястья. Меня, кстати, в свое время слегка насмешил первый эпизод "Очень странных дел", ибо там на 28ой минуте ленту наматывают прямо на перчатку, что на корню херит весь смысл:



4) На ступни натягиваются отдельные одноразовые бахилы, вдобавок ко вшитым в костюм.

5) На запястья натягиваются одноразовые нарукавники.

6) Надевается вторая пара одноразовых перчаток, имеющих отличный от первой пары цвет.

7) Для защиты дыхательных путей и волос было два возможных варианта:
- либо респиратор N95 (индекс означает, что тот способен фильтровать 95% частиц размером в 0.3мкм), и капюшон или сеточка
- либо powered air-purifying respirator (далее "PAPR"). Принцип работы оного несложен: компрессор на поясе гонит фильтрованный воздух через шланг в верхней части капюшона, создавая в капюшоне избыточное давление, и мешая болезнетворным микроорганизмам туда попасть.

Вот я во всем этом добре, и в PAPR. Фотография сделана до входа в "горячую зону", перчатки пока ещё чистые, так что то, что я держу в руке свой телефон -- нормально.



А респираторы я не любил. Во-первых, в самом начале мне примеряли различные модели респираторов, и первые два пропускали воздух во время теста, что не прибавило мне доверия к этому методу защиты. Тест там любопытный -- на плечи опускают закрытый сверху пластиковый цилиндр, и пшикают внутрь каким-то газом; если на языке чувствуется горечь -- маска течет. Причем без этого теста мне было очень трудно понять, течет ли она, так что привет людям, купившим из-за паники кучу респираторов N95 без всякой примерки. Ну и плюс мне было психологически некомфортно быть в "горячей зоне" с частично открытым лицом, пусть умом я и понимал, что опасность околонулевая. Но при работе с микроскопом приходилось надевать респиратор, что поделаешь, иначе трудно смотреть в окуляр. А некоторые у нас всё время в таком респираторе рассекали, им так больше нравилось:



У новичка надевание всей этой защиты занимает где-то 15-20 минут. У опытного человека -- несколько минут. Если надо выйти, например, в туалет, придется всё снимать, и потом надевать по новой.

Входим в "горячую зону"

Итак, защита надета. После этого открывается дверь в помещение 3 (снова приведу схему); при этом дверь между помещениями 1 и 2 блокируется, чтобы никто по ошибке не открыл её, пока открыта дверь в "горячую зону".



В зоне 3 был душ, кстати, но мы им никогда не пользовались. Когда лабораторию только начинали планировать, еще были свежими воспоминания о терактах 2001 года, так что она подготовлена к работе с более суровыми вещами чем "простой" туберкулез, например с сибирской язвой -- там пришлось бы принимать душ при каждом выходе из "горячей зоны"

В целях безопасности, в лаборатории всегда поддерживается т.н. отрицательное давление воздуха, т.е. давление воздуха чуть ниже атмосферного, чтобы обеспечить направленный поток воздуха в лабу, и предотвратить утечку тамошнего воздуха в коридор -- воздух снаружи постоянно подсасывался внутрь сквозь всякие там щели в дверях и т.п., дабы потом пройти через HEPA фильтры.



После корридора мы попадаем в зону четыре со схемы выше. Тут стоят холодильники с образцами и лежат запасы всякого-разного (на фото их нет, но сейчас полки под окном заполнены всякой всячиной). Само окно нужно, чтобы была возможность видеть происходящее в лаборатории не заходя туда. Правда, такие окна были далеко не во всех помещениях.



Через двери на фотографии выше мы может попасть в комнаты с кабинетами биозащиты. Вот одна из них (цифра 5 на схеме выше). Снова отметьте окно:



Работа с биоматериалом

Предположим, что в инкубаторе у нас дозрела классная культура туберкулеза (мы пользовались банальным штаммом H37RV), и настала пора сделать с ней что-нибудь эдакое. Несмотря на то, что уже после "тамбура" вся лаборатория считается "горячей зоной", самая грязная работа производится в кабинетах биозащиты, которые стоят у левой стены на фотографии выше. Принцип работы у них довольно простой: внутри кабинета создается идущий в вертикальном направлении ламинарный поток воздуха, в который подсасывается воздух снаружи кабинета, и потом этот воздушный поток проходит через HEPA фильтр.



Перед началом работы, т.е. перед тем как открыть мензурку с бактериальной культурой, кабинет нужно определенным образом подготовить. Ниже фотография времён моего обучения, запечатлена моя начальница. Обратите внимание на клеенку, и на синие микропипетки -- последние всё время лежат в кабинете, ибо полностью продезинфицировать их весьма трудно. А защиты на ней нет, потому что вся лаборатория тогда была "холодной", т.е. обеззараженной -- такое делается два раза в год, чтобы в течении нескольких недель провести обслуживание и ремонт оборудования, добавить что-то новое, обучать новичков в щадящих условиях, и так далее. Я помню, у нас однажды забарахлил микроскоп где-то через месяц после обслуживания. Лаба к тому времени была "горячей" и пригласить туда технарей из компании-производителя было нельзя -- ну, точнее, это было сопряжено с весьма большими сложностями. Так что я занимался сложной починкой и наладкой в своих двойных перчатках, получая ЦУ по скайпу. Удовольствие ниже среднего, прямо скажем.



Обратите внимание, как она держит руки. Кисти рук должны все время быть там, в кабинете. Если их надо оттуда вынимать, то сначала надо снять внешние перчатки, замочить их в антисептике, выбросить, и только после этого вынимать руки -- причем, надо тут же снова надеть новую пару перчаток, дабы не забыть.

Вот еще одна фотография, уже "боевая". Расстелена клеенка. Есть два красных мешка для мусора, один из них для колюще-режущих отходов. В правом нижнем углу видна баночка с антисептиком, в которой вымачивается специальная тряпочка, еще одна пропитанная антисептиком тряпка расстелена поверх клеенки. Хорошо видно, куда идет шланг от PAPR. Ну и отметьте, что запястья не лежат на передней решетке, ибо это блокирует воздух и нарушает ламинарное течение оного -- руки надо держать на весу, уперев локти в серый подлокотник.



Эта часть работы лично для меня была самой сложной -- всё время надо отдавать себе отчёт, где твои руки, что ты сейчас делаешь, чего касаешься. В среднем, работа в кабинете биозащиты для отдельно взятого эксперимента занимала у меня несколько часов (и это еще мало, иные там весь день проводят). И если за это время забыться хоть на секунду и, например, кратковременно вынуть из кабинета руку во внешней перчатке -- всё, это ЧП. Придется срочно сказать всем присутствующим выметаться из комнаты на два с половиной часа (дабы осела плавающая в воздухе дрянь), заполнить отчет о происшествии, получить ласковый нагоняй от начальства, и так далее. В общем работа эта весьма педантична, она не терпит коекакеров и торопыг. Вместе со мной обучение проходил крайне умный, но чересчур самоуверенный профессор -- и он не прошел экзамена, не был допущен к работе в BSL-3.

Обеззараживание и выход

После окончания эксперимента надо вычистить кабинет биозащиты и избавиться от мусора -- оставить кабинет нечищенным это жуткий косяк, в этой лабе я такое видел всего пару раз, и каждый раз устраивал разбор полётов. Отходы аккуратно собираются в мешок в определенной последовательности, все поверхности в кабинете тщательно вытираются спец.тряпкой с антисептиком, и так далее. После этого можно включить в кабинете УФ излучение для дополнительной стерилизации поверхностей.

Мешки с мусором относят в комнату с автоклавом (приспособление, которое стерилизует биоотходы большой температурой и давлением), у нас он был в помещении 6 на схеме:



Мусор помещают в специальные пластиковые бочки с крышками, и ставят те в автоклав. Фотографий нашего автоклава я в интернете не нашел, но этот вроде похож -- у нас тоже была похожая "рельсовая" система:



Обратите внимание, на схеме автоклав сообщается в комнатой снаружи -- там из вышеупомянутых бочек достают уже стерилизованные мусорные мешки, и складывают их в кучу; раз в неделю их оттуда забирает занимающаяся отходами компания. Автоклав запрограммирован так, чтобы внешняя дверь открывалась только после прохожения полного цикла стерилизации. До кучи, в каждую бочку заранее кладется специальная термочувствительная полоска, которая определенным образом меняет цвет когда цикл проходит успешно. У нас вот одно время была проблема, когда автоклав чудил, и полоски меняли цвет не совсем так, как надо было. Это тоже ЧП, которое приходилось документировать.

Итак, мусор убран, осталось уйти. Перед выходом из помещения 4 снимаются и выкидываются внешние перчатки, нарукавники и внешняя пара бахил. Далее надо брызнуть спреем с антисептиком на ступни, на запястья, и на руки. Уже в "тамбуре" снимается PAPR и костюм, последними снимаются и выкидываются внутренние перчатки. Всё! Можно идти и квасить работать над анализом данных.

Заключение

Извиняюсь, если написано слегка сумбурно, мне трудно было решить, что именно стоит описывать, и с какими подробностями. Если что-то осталось непонятым, или интересны дополнительные подробности -- спрашивайте в комментариях, буду рад ответить.

Ну и если вернуться к началу заметки, где упомянуты обвинения китайцев в небрежности -- как видите, в подобных лабораториях очень много держится на личной ответственности и аккуратности исполнителей. Являются ли такими все работники уханьской лаборатории? Не знаю. Но скажу честно, на основании личного опыта у меня сложилось впечатление, что приехавшие из Китая аспиранты-биологи не прочь срезать углы. Помню, у нас в соседней лабе пришел как-то утром народ, и охренел -- винда на контролирующем многомиллионный микроскоп компьютере вдруг вся стала на китайском языке. Оказалось, какой-то китайский аспирант-первогодка работал ночью, не смог сделать что-то нужное, и, недолго думая, переустановил винду на компе на тут же скачанную через университетский интернет китайскую пиратку.

В общем, лично я с самого начала подозревал именно утечку из лаборатории, и сейчас всё так же считаю эту версию наиболее вероятной.

Бонус

Ниже результат одного из моих экспериментов. Это не тубик, всего лишь M. smeg, но клетки у них выглядят одинаково. Вкратце, замысел тут такой: колония какое-то время растет в благоприятных условиях, затем туда на шесть часов добавляется антибиотик рифампицин, а потом он убирается и мы смотрим  -- какие бактерии смогли снова начать расти после воздействия антибиотика, а какие нет. Помнится, в вышеупомянутой публикации в PNAS у меня была база данных из более чем полусотни колоний, с информацией по длине бактерий и т.п. для каждого отдельно взятого кадра. Я всё это добро анализировал в матлабе, пытаясь выяснить, какие фенотипные характеристики бактерий коррелируют с устойчивостью к антибиотикам, и таки накопал кое-какие интересные связи. Продолжительность этой записи -- около суток (а для тубика такие записи вообще занимали целую неделю).

Оставить комментарий

Популярные посты:

• Ранее
• Архив