Линейные В-эпитопы гликопротеина S SARS-CoV-2
prof_afv — 25.03.2021
Тема этого поста на первый взгляд может показаться чересчур специальной. Но, на самом деле, всё это имеет прямое отношение к вакцинам, особенно пептидным. На всякий случай предупреждаю, текст нелёгок для понимания. Итак, что такое линейные В-эпитопы? Я об этом не раз писал, но поскольку не все читатели знакомы с полным собранием моих ЖЖ-сочинений, кое-что повторю. Зайду издалека - с элементарных сведений о белках и пептидах. Белки это полимеры аминокислот. Аминокислот двадцать. В белке они связаны друг с другом однотипной связью (она называется «пептидной») наподобие бус, в которых бусинки 20-ти цветов и они не нанизаны на нить, а сцеплены друг с другом «крючочками». В каждом белке своя неповторимая последовательность «бусинок»-аминокислот. Это и есть «первичная структура белка» (часто говорят «аминокислотная последовательность» или amino acid sequence). Но в естественных условиях в виде линейной последовательности (незапутанных бус) белки не существуют. Каждая цепочка из аминокислот причудливым образом складывается, свёртывается, переплетается и образует уникальную 3-мерную структуру (третичную структуру белка). Форму которую принимает «свёрнутый» белок или его части называют конформацией. В дополнение к этому некоторые белки состоят из нескольких полипептидных цепей и в таких случаях появляется ещё один уровень структурной организации - четвертичная структура белка. Одним из постулатов молекулярной биологии является «догма Анфинсена» (шведский биохимик, лауреат Нобелевской премии) – конформация белка полностью определяется его первичной структурой. Вообще-то из этой догмы есть загадочное исключение – белки, которые называются прионами, при одинаковой первичной структуре могут принимать разные конформации. Но этот отдельная большая тема и к сегодняшнему разговору она отношения не имеет.
Теперь о пептидах. Естественным путём они получаются при переваривании белков соответствующими ферментами (их называют протеолитическими). Из тех, что на слуху это трипсин, пепсин, папаин. Но для сегодняшней темы важнее синтетические пептиды. Впервые они были «сделаны» в 1963г. Сейчас синтез пептидов автоматизирован, и современные синтезаторы позволяют «изготавливать» пептиды с заданной аминокислотной последовательностью длиной до 100-120 аминокислот. Но такие длинные пептиды дороги и готовятся редко. А вот синтез пептидов длиной около 20 аминокислот поставлен на поток. Такие пептиды очень широко используются в иммунологии.
И, наконец, об эпитопах. Фундаментальным для иммунологии является понятие антиген. Это то, что распознаётся иммунной системой как «чужое» и инициирует иммунные реакции, конечная цель которых от чужого избавиться. Антигенами могут быть разные типы макромолекул, но прежде всего это белки. Так вот, адаптивная иммунная система распознаёт не белки целиком, а микроструктуры, как правило, находящиеся на их поверхности. Эти «бугорки», «холмики», «впадинки», образно выражаясь, элементы ландшафта поверхности белка, и называются эпитопами. В адаптивной иммунной системе имеется В- и Т- звенья. Элементарные сведения об этом здесь: https://prof-afv.livejournal.com/42161.html . В контексте сегодняшней темы важно, что эпитопы одного и того же белка, распознаваемые В- и Т- клетками совершенно различны. T-эпитопы, это всегда короткие непрерывные линейные участки полипептидной цепи. А вот В-эпитопы могут быть линейными, но чаще они конформационные. Как правило, они формируются НЕнепрерывными т.е. разделёнными, иногда очень далеко, участками полипептидной цепи. Конформационные эпитопы существуют только в контексте интактной третичной и, если она есть, четвертичной структуры белка. Это означает, что используя «обычные» относительно короткие пептиды, можно моделировать T-эпитопы и линейные B-эпитопы, но моделировать конформационные B-эпитопы синтетическими пептидами, за редкими исключениями, невозможно.
Теперь перехожу непосредственно к теме поста. Каталогизация линейных эпитопов, проводится следующим образом – синтезируется большое количество пептидов одинаковой длины, так чтобы начало каждого последующего было сдвинуто на несколько аминокислот. Таким образом, перекрывается вся аминокислотная последовательность исследуемого белка. Далее – самое важное, нужно определить на какие из этих пептидов иммунная система реагирует, а на какие нет. Для Т-эпитопов технически это очень сложно. Тем не менее, карта Т-эпитопов белков SARS-CoV-2 уже составлена (https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S266637912100015X). Для В-эпитопов технически это легче - нужно определить с какими пептидами природные антитела реагируют, а с какими нет. Но и картирование B-эпитопов это тоже объёмная и кропотливая работа и такие исследования белков SARS-CoV-2 единичны. Наиболее полное из них выполнено китайскими исследователями. Препринт их статьи доступен здесь: https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S2211124721002291.
В этой работе аминокислотная последовательность гликопротеина S была покрыта перекрывающимися пептидами длиной в 12 аминокислот c рамкой перекрытия 6 аминокислот. То есть первый пептид соответствовал аминокислотами 1-12, второй 7-18, и т.к. далее. Всего было синтезировано 211 таких частично перекрывающихся пептидов. Далее для каждого пептида было определено, реагирует ли он с антителами против SARS-CoV-2 в сыворотках крови больных COVID-19. Для этого были использованы сыворотки от 1051 больного. В качестве контроля использовались сыворотки 528 людей отрицательных на антитела против SARS-CoV-2. Технические детали опускаю, отмечу лишь, что подобная работа требует использования высокопроизводительных технологий (в этом исследовании это были microarrays). Полученные результаты суммированы на рисунке (взят из препринта статьи). Детали рисунка очень мелкие и их трудно разобрать, но общая картина, надеюсь, будет понятна. В центральной части рисунка горизонтально идёт полоса с цветными прямоугольниками. Это карта первичной последовательности гликопротеина S. Горизонтальная полоса над ней показывает границы S1 (включает SP, NTD, RBD, CTD1, CTD2 ) и S2 (включает FP, FPPR, HR1, CH, CD, HR2, TM, CP). Что означают эти названия для целей этого поста не важно. Это больше для специалистов. А вот для того, чтобы понять, что изображено в верхней части рисунка специалистом быть не нужно. Чётко видно, что с некоторыми пептидами сыворотки больных реагируют, а с другими нет. Каждая чёрная точка эта степень реагирования сыворотки больного с пептидом, находящимся в этом участке первичной аминокислотной последовательности - чем она выше, тех сильнее реактивность. Очевидно, что в верхней части рисунка есть области, где чёрных точек много, а в нижней чёрные точки почти все на уровне фона. Вверху показана реактивность сыворотками больных COVID-19, а внизу с контрольными отрицательными сыворотками. Таким образом, были идентифицированы линейные B-эпитопы гликопротеина S.
Полученные результаты оказались несколько неожиданными. Пожалуй, главная неожиданность, это почти полное отсутствие линейных B-эпитопов в RBD области белка S. Как это стыкуется с тем, что определение антител против RBD широко используется в диагностических тестах? Очень просто – в этих тестах определяются антитела против конформационных эпитопов, которые не моделируются пептидами. Ещё один интересный и неожиданный результат – распределение линейных B-эпитопов не коррелировало с местами (сайтами) гликозилирования. Считается, что гликозилирование «экранирует» аминокислоту от связывания с антителом. Но достаточно взгляда на рисунок (сайты гликозилирования показаны вертикальными чёрточками под картой белка S), чтобы убедиться, что в отношении линейных B-эпитопов белка S это не так. Ещё одно важное наблюдение – исключительно высокая вариабельность реактивности сывороток больных с пептидами, моделирующими линейные В-эпитопы. С индивидуальными эпитопами реагировало положительно от 11% до 69% сывороток больных. Профессионалы найдут в этой работе и другие интересные результаты, но на сегодня, думаю, достаточно.
Проф_АФВ
|
|
</> |
Феодосийский стрит-арт 
Нужна ли России борьба за независимость? (опрос) 
Доброе утро! 
Пробуждение 
Утреннее 
День самоуправления #7 в марафоне #веснаестьвесна 
Прощай, Асланьян 
Концлагерь Бухенвальд в рисунках и фотографиях 
