Обзор "Контроль возбудимых клеток с помощью света"

liartar — 27.12.2010 Некоторое время назад мне необходимо было написать небольшой обзор на произвольную тему "для галочки". Самым разумным было бы написать его кое-как, поскольку читать его, естественно, никто не будет. К сожалению, у меня далеко не всегда получается сделать что-то кое-как, особенно если это связано с интересной мне темой. Вообщем я довольно много времени потратил на написание этого обзора и теперь мне ужасно хочется, чтобы хоть кто-то имел потенциальную возможность его прочитать. Посему я выкладываю его здесь, если у вас вдруг возникнет желание... ну, вы поняли :) Конструктивная критика приветствуется.

Контроль возбудимых клеток с помощью света

В 1979 году журнал Scientific American издал специальный выпуск «The Brain». Этот выпуск по праву считается одним из лучших номеров этого знаменитого научно-популярного издания. Сборник из множества статей, рассказывающих о последних достижениях нейронауки, завершается обзором лауреата Нобелевской Премии Френсиса Крика, озаглавленным «Thinking about the brain» (Crick 1979). В тексте Френсис признается, что, не смотря на все открытия, сделанные в последние десятилетия, мы пока все равно очень плохо понимаем, как работает мозг человека. Нужно сказать, что в наше время, даже после «десятилетия мозга» и повсеместного внедрения функциональной магнитно-резонансной томографии, это утверждение остается правдой. После такого признания Крик замечает, что, по его мнению, нам недостает инструментария – методов исследования. Он пишет, что нам необходима техника, позволяющая контролировать определенные классы нейронов, оставляя другие клетки нетронутыми. В этом обзоре представлена появившаяся в последнее десятилетие методика использования оптогенетических исполнителей, из всех других современных методик наиболее хорошо соответствующая тому, о чем Крик писал в своей статье.

Что такое оптогенетика?

Слово «оптогенетика» можно определить как «ветвь биотехнологии, которая совмещает генную инженерию с оптикой для наблюдения и контроля функции целевых клеток с помощью света, часто в интактных животных» (Miesenbock 2009). Хотя первые оптогенетические методы появились в конце 90-х и начале 2000-х (Miyawaki, Llopis et al. 1997; Siegel and Isacoff 1997; Miesenbock, De Angelis et al. 1998; Zemelman, Lee et al. 2002; Zemelman, Nesnas et al. 2003; Banghart, Borges et al. 2004; Boyden, Zhang et al. 2005; Li, Gutierrez et al. 2005; Lima and Miesenbock 2005), само слово «оптогенетика» (optogenetics) появилось лишь в 2006 (Miller 2006).

Оптогенетические приспособления можно разделить на два класса: сенсоры и исполнители. Сенсоры переводят физиологические сигналы в оптические, делая таким образом внутриклеточные изменения видимыми. Исполнители переводят оптический сигнал в физиологический, позволяя контролировать клеточные функции. Эта симметрия между сенсорами и исполнителями очень важна, поскольку вместе они составляют комплексный экспериментальный пакет: посредством исполнителей можно влиять на работу системы, а сенсоры будут отражать как система отреагировала на вмешательство.

Оптогенетика была разработана для исследования нервной системы, однако потенциальная область применения оптогенетических методов распространяется далеко за её пределы, например, уже сейчас её успешно используют для исследования работы сердца (Arrenberg, Stainier et al. 2010; Bruegmann, Malan et al. 2010).

В данном обзоре речь пойдет об оптических и оптогенетических исполнителях, т.е. методиках, позволяющих контролировать активность нейронов с помощью света.

Развитие оптических методов

Свет давно привлекал нейробиологов в качестве инструмента управления нейронами, первые попытки контроля с помощью света датируются началом 70-х годов (Fork 1971). Причины это таковы: во-первых, для распространения в среде свету не нужен проводник (разве что для доставки света в глубину ткани). Во-вторых, достаточно просто генерировать серии вспышек любой продолжительности и частоты, используя свет нужной интенсивности и длины волны, причем луч света можно сделать сколь угодно тонким. После появления светодиодов и оптических кабелей, конкуренцию свету по удобству использования может составить разве что магнитное поле.

Чтобы осуществлять фотостимуляцию, необходимо сделать клетки чувствительными к свету. Для этого можно использовать три подхода, о которых будет рассказано ниже: (1) активируемые светом модифицированные, «запертые», сигнальные молекулы (“caged glutamate”, “caged ATP”), (2) модификации ионных каналов и рецепторов, делающие их светочувствительными и (3) использование природных светочувствительных белков-родопсинов.

«Запертые» сигнальные молекулы

Для многих нейромедиаторов и внитриклеточных мессенджеров, таких как Ca2+, возможно создание «запирающей» системы. Для этого к исходной молекуле химически присоединяют надстройку, не позволяющую этой молекуле соединиться с её рецептором. Подобная «запирающая» надстройка должна обладать специфическим свойством диссоциировать при воздействии света определенной длины волны. Такой «запертый» медиатор с помощью стереотаксической инъекции помещают в нужную ткань. Далее, в зависимости от используемого медиатора, мембранный потенциал или внутриклеточный сигналлинг может быть изменен, когда свет активирует высвобождение «запертых» сигнальных молекул. Не смотря на то, что глутамат – наиболее часто используемый медиатор, для многих других сигнальных молекул «запертые» формы также были синтезированы, что позволяет контролировать клеточную активность путем активации различных рецепторов, ассоциированных с G-белками и нижележащих сигнальных путей (Adams and Tsien 1993).

Активация «запертых» сигнальных молекул может быть использована для стимуляции индивидуальных частей нейронов, отдельных нейронов и даже целых сетей. В особенности, высвобождение глутамата стало важным инструментом для исследования дендритного древа (Shoham, O'Connor et al. 2005; Losonczy and Magee 2006) и картирования нейронных связей (Pettit, Helms et al. 1999). Совсем недавно, исследователи использовали этот метод для исследования взаимосвязей в коре путем возбуждения нейронов по нескольким тысячам сайтов и записи эффектов синаптической передачи (Yoshimura, Dantzker et al. 2005). Однако высвобождение глутамата и активация рецепторов занимает существенное время (от нескольких десятков миллисекунд) и не может поддерживать генерацию «пачек» потенциалов действия (ПД). Пространственное разрешение колеблется в пределах от 50 до 5 мкм (Shoham, O'Connor et al. 2005). Нужно заметить, что среди рассмотренных в этом обзоре методов, высвобождение глутамата в своем роде уникальный метод. При его использовании для активации нейронов вовлекаются те же типы рецепторов, что и при естественной активации путем высвобождения глутамата из пресинапса. Однако эта возможность безупречной физиологической мимикрии имеет обратную сторону. Во-первых, поскольку глутаматные рецепторы не представлены во многих возбудимых клетках, например, в кардиомиоцитах, использование этого метода по сути ограничено нервной системой. Во-вторых, в самой нервной системе глутаматные рецепторы экспрессируются практически всеми клетками, поэтому ограничиться возбуждением одного конкретного типа нейронов не получится.

Эти ограничения привели к разработке других методов, которые уже можно назвать оптогенетическими, поскольку они включают генно-инженерный компонент. Например, такова методика встраивания в необходимые клетки рецепторов капсаицина TRPV1 или пурина P2X2 и использования соответствующих «запертых» молекул (Zemelman, Nesnas et al. 2003). Когда ультрафиолетовый свет активирует высвобождение капсаицина или АТФ, клетки, экспрессирующие соответствующие каналы, генерируют ПД. Методика была недавно успешно использована для контроля локомоторной активности у свободно двигающихся мушек Drosophila (Lima and Miesenbock 2005). Эта система позволяет нацеливаться на определенные функциональные классы нейронов (поскольку только они будут экспрессировать нужные рецепторы) и других возбудимых клеток. Однако, как и высвобождение глутамата, подобные методики не поддерживают генерацию высокочастотных серий ПД (Zemelman, Nesnas et al. 2003).

Модифицированные ионные каналы и рецепторы

Азобензин – небольшая молекула, которой свойственна фотоизомеризация: при переключении с длинноволнового (580 нм) света на коротковолновый (380 нм) её физическая длина изменяется от 17 до 10 ангстрем. Если связать азобензин на одном конце с блокатором канала, а другим концом присоединить к самому каналу неподалёку от места связывания блокатора, то получится нечто вроде пробки на цепочке, которую можно выдергивать или вставлять обратно переключением светофильтра. Нечто подобное было проделано с калиевым каналом Shaker-типа (Banghart, Borges et al. 2004) и рецептором iGluR6 (Volgraf, Gorostiza et al. 2006) (во втором случае используется агонист рецептора, который при «длинной» конформации азобензина дотягивается до центра связывания, а при «короткой» – нет). Подобные методы отличаются относительно низким временным разрешение и также не поддерживают генерацию ритмов.

Природные светочувствительные белки

Наиболее прямой способ сделать клетку чувствительной к свету – использовать уже имеющиеся в природе светочувствительные белки, родопсины. Первая попытка проделать это включала использование мультикомпонентной родопсиновой системы дрозофилы (ChARGe) (Zemelman, Lee et al. 2002). Поскольку позвоночные и беспозвоночные используют разные каскады для зрения, потенциально возможен двухсторонний контроль нейронов: их можно и деполяризовать (с помощью ChARGe (Zemelman, Lee et al. 2002)), и гиперполяризовать (с помощью, например, крысиного родопсина RO4 (Li, Gutierrez et al. 2005)). Однако вероятно из-за того, что нефоторецепторные клетки структурно и физиологически не приспособлены для этих каскадов, нейроны, экспрессирующие вышеозначенные белки, реагируют на свет лишь спустя секунды после включения (Zhang, Wang et al. 2006).К тому же эти каскады требуют специфических экстраклеточных концентраций ионов.

Совсем недавно несколькими группами было показано, что возможно использование канал-родопсина-2 (сhannelrhodopsin-2, ChR2) из зеленой водоросли Chlamydomonas reinhardtii для придания быстрой светочувствительности нейронам (Nagel, Szellas et al. 2003; Boyden, Zhang et al. 2005; Li, Gutierrez et al. 2005; Ishizuka, Kakuda et al. 2006). При освещении голубым светом (длина волны ~470 нм) конформация канала меняется и он начинает пускать катионы (моно- и бивалентные) уже через 50 мкс после включения света (Nagel, Szellas et al. 2003). Это позволяет контролировать нейроны на миллисекундной шкале времени и, используя быстрые фотопереключатели, генерировать продолжительные и устойчивые ритмы на частотах до 30 Гц и более (Boyden, Zhang et al. 2005; Zhang, Wang et al. 2006).

Разнообразие светочувствительных белков

Кроме упомянутого выше ChR2, для оптогенетических целей также могут использоваться еще несколько микробных родопсинов, например, неселективный катионный канал, получивший название Volvox-channelrhodopsin-1 (VChR1), поскольку выделен из Volvox carteri (Zhang, Prigge et al. 2008), и хлорный переносчик галородопсин (NpHR) из археи Natronomonas pharaonis (Gradinaru, Thompson et al. 2008). Все эти каналы имеют различные предпочтения в спектральном составе света, максимально эффективно активирующем белок: ChR2 ~470 нм, VChR-1 ~535 нм, NpHR – ~589 нм (Zhang, Gradinaru et al. 2010). Это позволяет использовать их одновременно для двухстороннего контроля популяций нейронов.

Насколько хорошо работают оптогенетические исполнители?

Оптогенетические методики имею ряд ограничений, связанных с физическими характеристиками используемых исполнителей. В первую очередь стоит упомянуть, что сила воздействия на клетку и скорость развития этого воздействия находят в прочной обратной зависимости. Неудивительно, что чем плотнее связь между фотохимическими процессами и активацией ионных каналов, тем быстрее кинетика исполнителя. Те исполнители, которые используют промежуточные реакции, будь то вторичные мессенджеры (Zemelman, Lee et al. 2002; Li, Gutierrez et al. 2005) или фотолиз (Zemelman, Nesnas et al. 2003; Lima and Miesenbock 2005), отвечают со скоростью, измеряемой десятками миллисекунд. Исполнители канального типа, такие как ChR2 (Nagel, Szellas et al. 2003; Boyden, Zhang et al. 2005; Li, Gutierrez et al. 2005), LiGluR (Volgraf, Gorostiza et al. 2006; Szobota, Gorostiza et al. 2007) и галородопсин (Han and Boyden 2007; Zhang, Wang et al. 2007) в эксперименте могут контролироваться с миллисекундной или даже субмиллисекундной точностью. К сожалению, наиболее быстрые исполнители являются одновременно и наиболее слабыми. Итоговая проводимость одного исполнителя, использующего промежуточные реакции может в тысячу раз превышать проводимость исполнителя канального типа (Nagel, Szellas et al. 2003; Zemelman, Nesnas et al. 2003; Sjulson and Miesenbock 2008; Feldbauer, Zimmermann et al. 2009). Это колоссальная разница объясняет неэффективность микробных родопсинов в некоторых условиях (например, в центральной нервной системе взрослых дрозофил) и необходимость повышенной экспрессии во многих других.

Области применения

Ранние эксперименты с оптогенетическими исполнителями были по сути доказательством принципиальной возможности удаленного контроля нейронной активности и получения ожидаемого эффекта (Lima and Miesenbock 2005; Adamantidis, Zhang et al. 2007; Zhang, Wang et al. 2007). Новые данные, получаемые с использованием оптогенетических исполнителей, можно отнести к трем областям: прослеживание функциональных связей между областями мозга (Petreanu, Huber et al. 2007; Petreanu, Mao et al. 2009), анализ механизмов регуляции работы нейронных контуров (Clyne and Miesenbock 2008; Cardin, Carlen et al. 2009; Sohal, Zhang et al. 2009; Wyart, Del Bene et al. 2009) и поиски нервных основ когнитивной деятельности и поведения (Clyne and Miesenbock 2008; Huber, Petreanu et al. 2008; Cardin, Carlen et al. 2009; Claridge-Chang, Roorda et al. 2009; Wyart, Del Bene et al. 2009).

Заключение

В некоторых случаях возникает вопрос: зачем вообще использовать столь сложные и нагруженные методики, как контроль с помощью оптогенетических исполнителей? Дело в том, что доскональное понимание механизмов требует вмешательства. Это истина для генетики, желающей найти связь между фенотипом и геном; для биохимии, пытающейся выделить чистый белок и определить его функцию; естественно, это является истинной и для нейронауки, стремящейся изолировать нейронные сигналы, влияющие на поведение. Несущие информацию признаки таких сигналов крайне редко видны с самого начала. Они скорее могут быть найдены путем систематического исключения, модифицирования и реконструирования нейронной активности. Даже если бы наши наблюдения подтверждали, что определенная активность всегда сопровождает то или иное поведение, переход от корреляции к причинно-следственной связи в любом случае требует вмешательства.

Очень сложно представить себе как генетический код мог бы быть разгадан исключительно наблюдением. Колоссальный прогресс наступил, когда ученые смогли использовать синтетические триплеты: простейшие «инструкции» для рибосом (Judson 1979). Наши современные представления говорят о том, что оптогенетические «инструкции» для нервной системы могут стать субстратом для подобного прорыва в нейронауке в ближайшее время.

Список литературы

Adamantidis, A. R., F. Zhang, et al. (2007). "Neural substrates of awakening probed with optogenetic control of hypocretin neurons." Nature 450(7168): 420-424.
Adams, S. R. and R. Y. Tsien (1993). "Controlling cell chemistry with caged compounds." Annu Rev Physiol 55: 755-784.
Arrenberg, A. B., D. Y. Stainier, et al. (2010). "Optogenetic control of cardiac function." Science 330(6006): 971-974.
Banghart, M., K. Borges, et al. (2004). "Light-activated ion channels for remote control of neuronal firing." Nat Neurosci 7(12): 1381-1386.
Boyden, E. S., F. Zhang, et al. (2005). "Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neural activity." Nat Neurosci 8(9): 1263-1268.
Bruegmann, T., D. Malan, et al. (2010). "Optogenetic control of heart muscle in vitro and in vivo." Nat Methods 7(11): 897-900.
Cardin, J. A., M. Carlen, et al. (2009). "Driving fast-spiking cells induces gamma rhythm and controls sensory responses." Nature 459(7247): 663-667.
Claridge-Chang, A., R. D. Roorda, et al. (2009). "Writing memories with light-addressable reinforcement circuitry." Cell 139(2): 405-415.
Clyne, J. D. and G. Miesenbock (2008). "Sex-specific control and tuning of the pattern generator for courtship song in Drosophila." Cell 133(2): 354-363.
Crick, F. H. (1979). "Thinking about the brain." Sci Am 241(3): 219-232.
Feldbauer, K., D. Zimmermann, et al. (2009). "Channelrhodopsin-2 is a leaky proton pump." Proc Natl Acad Sci U S A 106(30): 12317-12322.
Fork, R. L. (1971). "Laser stimulation of nerve cells in Aplysia." Science 171(974): 907-908.
Gradinaru, V., K. R. Thompson, et al. (2008). "eNpHR: a Natronomonas halorhodopsin enhanced for optogenetic applications." Brain Cell Biol 36(1-4): 129-139.
Han, X. and E. S. Boyden (2007). "Multiple-color optical activation, silencing, and desynchronization of neural activity, with single-spike temporal resolution." PLoS One 2(3): e299.
Huber, D., L. Petreanu, et al. (2008). "Sparse optical microstimulation in barrel cortex drives learned behaviour in freely moving mice." Nature 451(7174): 61-64.
Ishizuka, T., M. Kakuda, et al. (2006). "Kinetic evaluation of photosensitivity in genetically engineered neurons expressing green algae light-gated channels." Neurosci Res 54(2): 85-94.
Judson, H. F. (1979). The Eighth Day of Creation. New York, Simon and Schuster.
Li, X., D. V. Gutierrez, et al. (2005). "Fast noninvasive activation and inhibition of neural and network activity by vertebrate rhodopsin and green algae channelrhodopsin." Proc Natl Acad Sci U S A 102(49): 17816-17821.
Lima, S. Q. and G. Miesenbock (2005). "Remote control of behavior through genetically targeted photostimulation of neurons." Cell 121(1): 141-152.
Losonczy, A. and J. C. Magee (2006). "Integrative properties of radial oblique dendrites in hippocampal CA1 pyramidal neurons." Neuron 50(2): 291-307.
Miesenbock, G. (2009). "The optogenetic catechism." Science 326(5951): 395-399.
Miesenbock, G., D. A. De Angelis, et al. (1998). "Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins." Nature 394(6689): 192-195.
Miller, G. (2006). "Optogenetics. Shining new light on neural circuits." Science 314(5806): 1674-1676.
Miyawaki, A., J. Llopis, et al. (1997). "Fluorescent indicators for Ca2+ based on green fluorescent proteins and calmodulin." Nature 388(6645): 882-887.
Nagel, G., T. Szellas, et al. (2003). "Channelrhodopsin-2, a directly light-gated cation-selective membrane channel." Proc Natl Acad Sci U S A 100(24): 13940-13945.
Petreanu, L., D. Huber, et al. (2007). "Channelrhodopsin-2-assisted circuit mapping of long-range callosal projections." Nat Neurosci 10(5): 663-668.
Petreanu, L., T. Mao, et al. (2009). "The subcellular organization of neocortical excitatory connections." Nature 457(7233): 1142-1145.
Pettit, D. L., M. C. Helms, et al. (1999). "Local excitatory circuits in the intermediate gray layer of the superior colliculus." J Neurophysiol 81(3): 1424-1427.
Shoham, S., D. H. O'Connor, et al. (2005). "Rapid neurotransmitter uncaging in spatially defined patterns." Nat Methods 2(11): 837-843.
Siegel, M. S. and E. Y. Isacoff (1997). "A genetically encoded optical probe of membrane voltage." Neuron 19(4): 735-741.
Sjulson, L. and G. Miesenbock (2008). "Photocontrol of neural activity: biophysical mechanisms and performance in vivo." Chem Rev 108(5): 1588-1602.
Sohal, V. S., F. Zhang, et al. (2009). "Parvalbumin neurons and gamma rhythms enhance cortical circuit performance." Nature 459(7247): 698-702.
Szobota, S., P. Gorostiza, et al. (2007). "Remote control of neuronal activity with a light-gated glutamate receptor." Neuron 54(4): 535-545.
Volgraf, M., P. Gorostiza, et al. (2006). "Allosteric control of an ionotropic glutamate receptor with an optical switch." Nat Chem Biol 2(1): 47-52.
Wyart, C., F. Del Bene, et al. (2009). "Optogenetic dissection of a behavioural module in the vertebrate spinal cord." Nature 461(7262): 407-410.
Yoshimura, Y., J. L. Dantzker, et al. (2005). "Excitatory cortical neurons form fine-scale functional networks." Nature 433(7028): 868-873.
Zemelman, B. V., G. A. Lee, et al. (2002). "Selective photostimulation of genetically chARGed neurons." Neuron 33(1): 15-22.
Zemelman, B. V., N. Nesnas, et al. (2003). "Photochemical gating of heterologous ion channels: remote control over genetically designated populations of neurons." Proc Natl Acad Sci U S A 100(3): 1352-1357.
Zhang, F., V. Gradinaru, et al. (2010). "Optogenetic interrogation of neural circuits: technology for probing mammalian brain structures." Nat Protoc 5(3): 439-456.
Zhang, F., M. Prigge, et al. (2008). "Red-shifted optogenetic excitation: a tool for fast neural control derived from Volvox carteri." Nat Neurosci 11(6): 631-633.
Zhang, F., L. P. Wang, et al. (2006). "Channelrhodopsin-2 and optical control of excitable cells." Nat Methods 3(10): 785-792.
Zhang, F., L. P. Wang, et al. (2007). "Multimodal fast optical interrogation of neural circuitry." Nature 446(7136): 633-639.

Оставить комментарий

Популярные посты:

• Архив